Une projection excitatrice directe des neurones de la couche entorhinale 6b vers l'hippocampe contribue au codage spatial et à la mémoire

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4826 (2022) Citer cet article

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La formation hippocampique des mammifères (HF) joue un rôle clé dans plusieurs fonctions cérébrales supérieures, telles que le codage spatial, l'apprentissage et la mémoire. Son architecture de circuit simple est souvent considérée comme une boucle trisynaptique, traitant les entrées provenant des couches superficielles du cortex entorhinal (EC) et les renvoyant à ses couches plus profondes. Ici, nous montrons que les neurones excitateurs dans la couche 6b du projet CE de souris à toutes les sous-régions comprenant le HF et reçoivent des entrées du CA1, du thalamus et du claustrum. De plus, leur sortie est caractérisée par des courants postsynaptiques excitateurs à décroissance lente uniques capables de conduire des potentiels de type plateau dans leurs cibles postsynaptiques. L'inhibition optogénétique de la voie EC-6b affecte le codage spatial dans les neurones pyramidaux CA1, tandis que l'ablation cellulaire altère non seulement l'acquisition de nouveaux souvenirs spatiaux, mais également la dégradation de ceux déjà acquis. Nos résultats fournissent la preuve d'un rôle fonctionnel pour les neurones de la couche corticale 6b dans le cerveau adulte.

L'hippocampe est une région corticale du cerveau des mammifères nécessaire aux processus mnémoniques et au comportement lié à l'espace1. Sur la base de travaux morphologiques classiques, le circuit de la formation hippocampique (HF) est souvent considéré comme une boucle, qui commence aux deux couches superficielles 2 et 3 du cortex entorhinal (CE) et se termine dans ses couches profondes2,3 après avoir été relayée à travers les principales sous-régions de l'hippocampe - gyrus denté (DG), CA3 et CA1 - de manière unidirectionnelle4,5. À la lumière de cette architecture de circuit, il est surprenant que diverses manipulations des couches superficielles de la CE n'entraînent que des changements mineurs dans l'activité et la dynamique des neurones principaux de l'hippocampe6,7,8,9,10,11. Ainsi, la présence de voies synaptiques alternatives doit être considérée.

Nous avons récemment développé une technique de marquage rétrograde transsynaptique fiable et efficace basée sur la rage12, qui améliore les technologies existantes13,14. En utilisant cette technique, nous avons constaté que l'hippocampe reçoit non seulement une entrée canonique des couches 2 et 3 de l'EC, mais également de ses couches profondes, en particulier la couche 612. Comme la couche 6 constitue une partie importante de l'EC et contient une grande proportion de neurones excitateurs, cette région du cerveau peut avoir un impact considérable sur l'activité du réseau hippocampique. À ce jour, les neurones de cette couche ont été classés exclusivement par leur morphologie dendritique polymorphe caractéristique2,3,15,16. Bien qu'il ait été démontré que cette couche abrite des cellules avec des schémas de déclenchement spatialement sélectifs, rappelant l'activité des cellules de la grille17, aucune caractérisation moléculaire, anatomique, physiologique ou fonctionnelle détaillée de cette population cellulaire n'a été réalisée.

Une difficulté majeure dans l'analyse de la fonction de la couche 6 est son organisation complexe. Bien que la couche corticale 6 soit souvent considérée comme une seule couche uniforme, les neurones de la couche 6b (parfois appelée couche 718) sont différents des neurones de la couche 6a sur le plan du développement, génétiquement et morphologiquement19,20. Les neurones de la couche 6b se différencient beaucoup plus tôt que les neurones de la couche 6a et expriment plusieurs marqueurs spécifiques aux neurones de la sous-plaque (SPN), notamment la complexine 3 (Cplx3), la neurexophiline 4 (Nxph4) et le facteur de croissance du tissu conjonctif (Ctgf)21,22, 23. Bien que l'on pense généralement que les SPN sont une population transitoire24,25, la présence d'une fraction persistante de SPN a été démontrée22,26. Notamment, la couche entorhinale 6 est plus proche de la couche corticale 6b27, plutôt que de la couche 6a28, et semble souvent être continue avec la fine couche cellulaire censée représenter le reste de la sous-plaque18,24,26. Ces résultats soulèvent la possibilité qu'au-delà de leur fonction dans le développement cortical24,29,30,31, les neurones de la couche 6b puissent réguler la fonction de circuit dans l'hippocampe adulte. Cependant, cette hypothèse n'a pas été testée directement.

Pour étudier la connectivité et la fonction de réseau de l'entrée de la couche profonde EC dans l'hippocampe, nous avons combiné le marquage transsynaptique basé sur le virus de la rage, la caractérisation moléculaire, l'électrophysiologie, l'optogénétique et l'analyse comportementale. Nous avons constaté que, dans le cerveau adulte, les neurones EC-6b sont connectés de manière monosynaptique aux neurones principaux de l'hippocampe et ont un effet étonnamment puissant sur l'activité du réseau hippocampique, du neurone unique au niveau comportemental.

Pour parvenir à une meilleure caractérisation moléculaire des neurones EC-6, nous avons d'abord examiné l'expression de plusieurs marqueurs neuronaux (Fig. 1a – c supplémentaires). Nous avons constaté que cette couche n'exprime pas de marqueurs connus pour la couche néocorticale 6a, tels que Ntsr1, mais était riche en biomarqueurs connus pour les SPN, tels que Cplx3, Nxph4 et Ctgf21,22,23 (Fig. 1a – c supplémentaire). En utilisant une base de données de séquençage d'ARN unicellulaire et l'hybridation in situ fluorescente (FISH), nous avons constaté que dans le cortex postérieur adulte, ces gènes SPN caractéristiques sont de puissants marqueurs de sélection pour une population distincte de neurones excitateurs, uniques à la fois dans la couche corticale 6 cluster et dans la plaque corticale dans son ensemble (Fig. 1d – h supplémentaire). Conformément à ces observations, l'immunomarquage pour CPLX3 a produit un signal fort dans les somates des cellules de la couche corticale la plus profonde, appelée couche 6b ou sous-plaque (définie comme une bande de 50 μm de large au-dessus de la substance blanche22) mais aussi le long de la couche corticale et hippocampique 1 , c'est-à-dire la strate moléculaire (SM), où seuls quelques somates CPLX3 + ont pu être détectés (Fig. 1a et Fig. 2a et b supplémentaires).

une section horizontale représentative colorée pour CPLX3 et DAPI (à gauche) à côté d'une vue élargie du cortex (à droite). b Images STED représentatives de LEC-1, colorées pour CPLX3 aux côtés de VGluT1 (en haut à gauche) ou de VGAT (en bas à gauche). Les inserts étendus sont affichés à droite de chaque image au-dessus de leur masque correspondant, démontrant le calcul de la colocalisation pour chaque marqueur. c Analyse de la densité synaptique, à l'aide d'images STED acquises à partir des champs indiqués par des carrés pointillés verts en (a). La densité synaptique a été calculée ici comme le rapport entre la zone du signal et la zone totale de l'image. d Densité relative des signaux eCPLX3 et iCPLX3 de la zone totale de signal VGluT1 ou VGAT. L'injection unilatérale de retAAV dans le CA1 permet le ciblage génétique du CA3 controlatéral pour le marquage rétrograde, en exploitant l'abondance des axones commissuraux des neurones pyramidaux CA3 (schémas du haut). Coupes horizontales représentatives de l'hippocampe médio-dorsal des hémisphères ipsilatéral (en bas à gauche) et controlatéral (en bas au centre) pour l'injection de RetAAV-cre. Les neurones à double marquage dans l'encart agrandi (en bas à droite) sont des cellules starter putatives. f, g Une coupe horizontale représentative de l'hippocampe ventral après un marquage rétrograde spécifique à CA3 révèle une population de neurones dans la couche la plus profonde de l'EC (f), dont les immunomarqueurs sont positifs pour le marqueur spécifique à la sous-plaque CPLX3 (72/78 cellules comptées à partir de 5 animaux, g). h Coupes horizontales représentatives de la couche 6b après marquage rétrograde avec CVS-N2c(deltaG)-tdTomato, à partir de neurones CA3 d'une souris GAD1-EGFP (à gauche). Les nombres au-dessus des barres dans le panneau de droite indiquent le nombre total de somates tdTomato+/EGFP+ à double marquage sur le total de somates tdTomato+ pour chacune des régions examinées (P = 1,2 × 10−9 ; test exact de Fisher bilatéral) . i Deux pSPN projetant du CA3 marqués à la biocytine (magenta) d'une section hippocampique aiguë (à gauche) et un élargissement d'un segment dendritique (à droite). L'expérience a été reproduite pour 12 cellules avec des résultats identiques. j Traces représentatives des EPSC spontanés (trace du haut) et du potentiel de membrane suite à des injections de courant de -50 pA (bleu), 100 pA (rouge) et 200 pA (noir ; traces du bas). Le graphique récapitulatif ci-dessous montre la fréquence de tir en fonction de l'amplitude du courant (N = 31 cellules). Les barres d'échelle pour les EPSC représentatifs agrandis (trace du haut) et le premier AP au courant de rhéobase (trace du bas) indiquent respectivement 25 ms/20 pA et 2 ms/20 mV. N en c, d représente le nombre de sections individuelles de 6 animaux différents. Les données en c, d, j sont présentées sous forme de moyenne et de SEM.

Comme CPLX3 est une protéine synaptique33, nous avons émis l'hypothèse que l'immunoréactivité de CPLX3 le long du SM pourrait indiquer l'existence de synapses issues de la population de SPN persistants. En utilisant l'imagerie par épuisement des émissions stimulées (STED) du SM provenant de différentes sous-régions hippocampiques et parahippocampiques, nous avons pu confirmer que dans ces régions, CPLX3 colocalisait largement avec le transporteur vésiculaire du glutamate 1 (VGluT1) et le transporteur vésiculaire GABA (VGAT ), respectivement. Ces terminaux CPLX3 + excitateurs ou inhibiteurs (eCPLX3 / iCPLX3) ont été détectés dans des proportions similaires les unes aux autres, mais dans des proportions variables dans les différentes sous-régions de la HF (Fig. 1b, c et Supplémentaire Fig. 2c, d). Une exception notable a été observée dans le CA3 SM, où les terminaux eCPLX3 représentaient près de 15 % de tous les terminaux glutamatergiques, tandis que les terminaux iCPLX3 représentaient moins de 5 % de tous les terminaux GABAergiques.

Pour tester si ces terminaux proviennent de neurones EC-6b, nous avons génétiquement ciblé les neurones pyramidaux CA3 pour le marquage rétrograde transsynaptique en injectant d'abord le CA1 controlatéral de la lignée de rapporteurs cre tdTomato Ai9, avec le virus adéno-associé transportable rétrograde (retAAV)34 exprimant cre -recombinase, et le CA3 homolatéral avec le virus adéno-associé (AAV) exprimant une cassette TVA-2A-N2cG cre-dépendante. Une injection ultérieure de vecteurs viraux de la rage CVS-N2c pseudotypés envA et G-délétés (RVdGenvA-CVS-N2c) exprimant EGFP12,14, deux semaines après l'application des deux AAV, a conduit à un marquage rétrograde extensif et spécifique des neurones pyramidaux CA3 ( Fig. 1d et Supplémentaires Fig. 3a, b). En accord avec les connaissances antérieures35, un signal EGFP répandu a pu être observé le long de la couche 2 de l'EC médian et latéral (MEC et LEC, respectivement) et conformément à notre prédiction, également dans les neurones CPLX3 + EC-6b (Fig. 1e, f). Étant donné que dans le cerveau en développement, la couche de sous-plaque peut donner naissance à la fois à des neurones de projection excitateurs et inhibiteurs36, nous avons effectué une expérience de marquage rétrograde supplémentaire en utilisant des souris GAD1-EGFP et avons constaté que la grande majorité des neurones de projection de EC-6b étaient GAD1 -négatif (Fig. 1h et Supplémentaire Fig. 3c, d). Les enregistrements électrophysiologiques intracellulaires et l'imagerie ultérieure des neurones projetant CA3 remplis de biocytine dans EC-6b ont révélé une arborisation polymorphe de dendrites densément épineuses (Fig. 1i), des courants post-synaptiques excitateurs spontanés (EPSC) et une activité de pointe modérée en réponse aux injections de courant ( Fig. 1j et tableau supplémentaire 1). Ces observations suggèrent que les neurones de la couche la plus profonde de l'EC sont des SPN persistants, en continuité avec la couche corticale 6b, et confirment l'existence d'une projection excitatrice directe vers le SM de l'hippocampe CA3. En revanche, les terminaux iCPLX3 que nous avons détectés peuvent provenir d'interneurones locaux Cplx3 + SM, correspondant au profil moléculaire des cellules neurogliaformes de la couche 1 décrites précédemment (Fig. 4a, d supplémentaires). Pris ensemble, ces résultats démontrent la présence d'une connexion synaptique excitatrice directe des neurones EC-6b à l'hippocampe.

Pour évaluer l'étendue anatomique des neurones EC-6b projetant CA3 et quantifier leur proportion relative par rapport aux autres populations corticales projetant CA3, nous avons disséqué, effacé optiquement et imagé l'ensemble du HF, en utilisant la microscopie confocale, après un marquage rétrograde transsynaptique de le CA3 (Fig. 2a, b). L'analyse qui en a résulté a révélé que des neurones projetant CA3 se trouvaient le long de tout l'axe dorso-ventral de l'EC-6b avec une densité sensiblement plus élevée près de son pôle ventral, à l'opposé du LEC (Fig. 2c).

un aperçu schématique en 3D des différents composants composant la formation hippocampique. A, D, M indiquent respectivement Antérieur, Dorsal et Médial. b Préparation cortico-hippocampique intacte et nettoyée après marquage assisté par retAAV des neurones CA3, comme illustré à la Fig. , en bas) et une image annotée de la préparation dans le plan Z (à droite). c Représentation visuelle de la distribution des neurones marqués N2c-EGFP dans l'EC et le HC, après marquage rétrograde du CA3. d, schéma de marquage rétrograde spécifique à CA1 (en haut à gauche) et images confocales représentatives du HC (en bas à gauche) et de l'EC (à droite). e Identique à c mais pour le marquage rétrograde du CA1. f Schéma de marquage rétrograde spécifique au DGC (en haut à gauche) et images confocales représentatives du HC (en bas à gauche) et de l'EC (à droite). g Identique à c mais pour l'étiquetage rétrograde du DG. h Schéma de marquage rétrograde spécifique à CA1 IN (en haut à gauche) et images confocales représentatives du HC (en bas à gauche) et de l'EC (à droite). i, Identique à c mais pour le marquage rétrograde des interneurones de l'hippocampe. j Distribution de l'étiquetage dans les sous-régions cortico-hippocampiques suite à l'étiquetage rétrograde de CA3, CA1 et DG. La fraction dans chaque région a été calculée séparément pour chaque condition du nombre total de neurones de 2ème ordre. k Fraction de SPN entorhinaux sur le nombre total de neurones de projection dans l'EC, après marquage rétrograde des interneurones CA3, CA1, DG et hippocampique. l Nombre de neurones de 2e et 1er ordre pour chaque population de départ (à gauche) ainsi qu'un graphique récapitulatif des ratios calculés de neurones de 2e à 1er ordre (à droite). Pour tous les calculs, le nombre de cellules CA3 et moussues a été multiplié par 2 pour tenir compte du nombre de neurones de projection commissuraux. Pour DG, n = 6, pour toutes les autres conditions, n = 4 souris. Sauf indication contraire, les barres d'échelle représentent 200 µm. L'image dans a a été acquise à l'aide de l'Allen Institute's Brain Explorer 2™. Les données en jl sont présentées sous forme de moyenne et de SEM avec des points de données individuels indiqués pour chaque expérience.

Étant donné que les terminaux eCPLX3 ont également été observés dans le SM de toutes les autres sous-régions de l'hippocampe, bien qu'à des densités plus faibles, nous avons étendu cette approche pour inclure le marquage rétrograde des interneurones CA1, DG et hippocampique. Pour identifier les partenaires présynaptiques des neurones pyramidaux CA1, ces cellules ont été ciblées par injection d'une cassette cre-off AAV, sous contrôle du promoteur CaMKIIa12 dans la région CA1 de souris KA1-cre, dans laquelle cre s'exprime sélectivement dans le CA3 et DG38 ( Fig. 2d), empêchant ainsi le marquage rétrograde de CA3 à proximité et de la plupart des neurones CA2 (Fig. 5a, b supplémentaires). Ces expériences ont révélé qu'en plus de l'entrée principale EC-3 et d'une entrée EC-5a, qui a récemment été décrite plus en détail39 (Fig. 5c, d supplémentaires), les neurones CA1 recevaient également une entrée substantielle du pôle dorsal du EC-6b, en face du MEC (Fig. 2d, e, j) qui, similaire à la projection EC-6b vers le CA3, est principalement constitué de neurones excitateurs (Fig. 6a supplémentaire).

Pour identifier les partenaires présynaptiques des cellules granulaires dentées (DGC), nous avons injecté des AAV cre-dépendants dans la lignée Prox1-cre spécifique au DGC (Fig. 2f). Nous avons constaté que cette population recevait une entrée excitatrice uniformément distribuée, mais clairsemée de l'EC-6b (Fig. 2f – j et Fig. 6b supplémentaire). Enfin, pour déterminer si la projection EC-6b pourrait recruter une inhibition par anticipation, en plus de l'excitation, nous avons effectué un marquage rétrograde en utilisant RVdGenvA-CVS-N2c-tdTomato à partir d'IN hippocampiques, au moyen de l'expression médiée par l'AAV d'un flp-dépendant cassette dans l'hippocampe de la lignée DLX5 / 6-FlpE spécifique à l'IN, croisée avec une lignée rapporteur EGFP Flp12 (Fig. 2h et Fig. 6c supplémentaire). Les cellules marquées de manière rétrograde comprenaient des neurones principaux dans l'hippocampe et dans les couches corticales superficielles, ainsi qu'un marquage très clairsemé des neurones dans EC-6b (Fig. 2h – j et Supplémentaire Fig. 6d, e). Ce résultat suggère que les neurones EC-6b recrutent moins d'inhibition par anticipation que les neurones EC-2/3, ce qui augmente potentiellement leur contribution relative à la commande excitatrice extrinsèque globale des neurones pyramidaux de l'hippocampe.

Pour déterminer la contribution relative des entrées excitatrices d'EC-6b sur chacune de ces populations d'hippocampes, nous avons calculé pour chaque souris la fraction de neurones marqués rétrogradement dans la couche 6b de la population totale marquée dans toutes les couches EC (Fig. 2k). Nous avons constaté que ce rapport suivait les estimations relatives de la densité synaptique eCPLX3/VGluT1 décrites à la Fig. 1c. Les ratios indiqués sur la figure 1c et ceux de la figure 2k ont ​​fourni des estimations indépendantes, mais très similaires, de la contribution de la projection EC-6b à l'entrée corticale nette, apportant ainsi un soutien supplémentaire à ces résultats. Cette validation croisée permet une approximation de la contribution relative de cette projection dans des régions qui ne peuvent pas être facilement disséquées pour un étiquetage rétrograde, en utilisant la quantification de la densité synaptique locale eCPLX3. Une quantification supplémentaire du rapport de neurones de 2e / 1er ordre pour les populations de neurones excitateurs a confirmé le marquage à haut débit dans toutes les conditions, avec des rapports inférieurs observés après le marquage rétrograde du DG (Fig. 2l), potentiellement en raison d'un degré élevé de divergence par rapport à un petit nombre de neurones EC à un grand nombre de DGC40. Ces résultats démontrent que la projection EC-6b cible toutes les sous-populations hippocampiques, avec une préférence pour les neurones excitateurs dans CA1 et CA3.

Nos résultats fournissent une description détaillée de la projection hippocampique EC-6b. Cependant, pour comprendre quel type d'information ces cellules relaient, une caractérisation fonctionnelle parallèle de ses entrées synaptiques est nécessaire. Nous avons constaté que la lignée pilote Ctgf-2A-dgCre permet une dissection génétique inductible des neurones excitateurs Cplx3 + EC-6b, mais pas des IN Cplx3 + EC couche 1 ou des IN hippocampiques SM, lors de l'administration de l'antibiotique triméthoprime (TMP) (Fig. 3a et Fig. 7a–c supplémentaires). Ces souris ont ensuite été utilisées pour cibler l'EC-6b pour un double marquage antérograde et rétrograde, médié par une combinaison de vecteurs AAV et RVdGenvA-CVS-N2c dépendants de cre, afin de reconstruire leur réseau étendu de connexions (Fig. 3b et Supplémentaire Fig. 7d, e).

a Des sections horizontales représentatives de la souris Ctgf-2A-dgCre croisées avec la lignée de rapporteurs Ai9 tdTomato démontrent une dissection génétique efficace inductible par le TMP des neurones Cplx3 + dans la couche corticale 6b. b Une illustration du schéma d'injection AAV pour le double marquage antérograde et rétrograde spécifique à la sous-plaque. c, d Une section horizontale représentative après marquage rétrograde de la sous-plaque entorhinale et immunomarquage pour NeuN (c) et des sections coronales représentatives (d), démontrant les projections vers et depuis les régions corticales et sous-corticales. e Une section horizontale représentative, immunomarquée pour CPLX3 (à gauche) et des vues améliorées de la zone de transition CA3-CA1 et des couches profondes de l'EC, après immunomarquage pour PCP4. ld—lamina dissecans. f Graphiques récapitulatifs montrant le nombre de neurones de toutes les régions faisant saillie vers la sous-plaque entorhinale, par rapport au nombre total de neurones EGFP+ comptés dans chaque préparation, mesurés à partir de tissus corticaux et de tronc cérébral intacts et nettoyés (n = 6 souris). g, Densité d'étiquetage des noyaux NeuN + + EGFP + dans les régions clés, par rapport à leur nombre total respectif de NeuN (n = 5 souris). Les données en f, g sont affichées sous forme de points de données individuels (cercles vides), moyenne (cercles pleins) et SEM.

Le traçage des axones à partir des neurones tdTomato + a révélé que, mis à part les structures au sein du HF, précédemment jugées immunoréactives pour CPLX3, cette population se projetait également de manière clairsemée vers le noyau septal latéral (LS) et les régions lamellaires des noyaux thalamiques antérieurs (ATN). Le traçage rétrograde concomitant avec RVdGenvA-CVS-N2c-EGFP a révélé des projections vers les neurones EC-6b du noyau septal médial (MS) et de la bande diagonale de Broca (DBB), ainsi que les noyaux du noyau thalamique comprenant l'ATN (AD—Anterodorsal ; AM—antéromédial ; AV—antéroventral) avec le noyau reuniens (Re) (Fig. 3d). De la plaque corticale, des projections clairsemées provenaient du cortex cingulaire (Cg), du cortex rétrosplénial (RSC) et de l'amygdale cortico-basale (CoA). Alors que toutes ces régions étaient auparavant associées au réseau étendu de l'hippocampe, nous avons également trouvé une projection proéminente de toute l'étendue antéro-postérieure du claustrum (Cla), dont l'association avec le HF est rarement notée (Fig. 3c, d, f, g). Les neurones EC-6b ont également reçu de nombreux apports de sous-populations spécifiques au sein de la HF ; de l'hippocampe proprement dit, l'entrée excitatrice provient exclusivement du CA1 et du subiculum, ainsi qu'une population de neurones potentiellement inhibiteurs dans le CA3 Stratum oriens et radiatum. De l'intérieur de l'EC, la couche 5a est apparue comme la principale source d'entrée à EC-6b, avec une entrée plus clairsemée des autres couches corticales, se distinguant par l'étiquetage de PCP4 qui s'est avéré être exprimé de manière sélective dans les neurones EC-3 et EC-5b. , mais pas EC-2 et EC-5a43 (Fig. 3e–g).

Toutes les preuves présentées jusqu'à présent indiquent l'existence d'une connexion synaptique structurelle entre les neurones EC-6b et les neurones principaux de l'hippocampe. Cependant, il est toujours possible que ces contacts ne soient que des vestiges structurels des premiers stades de développement et ne représentent pas des synapses fonctionnelles dans le cerveau adulte. Pour aborder cette possibilité, nous avons exprimé un actionneur optogénétique dans la couche 6b en croisant la lignée Ctgf-2A-dgCre avec des souris Ai32, qui expriment conditionnellement ChR2 (H134R) -EYFP, et mesuré les réponses induites par optogénétique des neurones pyramidaux dans CA3b (Fig. 4a et Supplémentaire Fig. 8a–c). Pour comparer les propriétés physiologiques de la projection EC-6b vers le CA3 avec d'autres voies connues, nous avons également exprimé des actionneurs spécifiquement dans les neurones EC-2 et les DGC. Le premier a été réalisé au moyen d'un étiquetage rétrograde du DG, qui a conduit à un étiquetage étendu de EC-2, mais seulement à un étiquetage clairsemé de EC-6b (Fig. 4b et Fig. 8d – j supplémentaires), et le second au moyen de Injection d'AAV-EF1a-DIO-ChIEF-2A-dTomato dans le DG de souris Prox1-cre (Fig. 4c). Alors que des réponses postsynaptiques ont été observées après la stimulation de la voie EC-6b, elles étaient nettement différentes de celles des projections de la voie perforante (PP) ou des fibres moussues (MF) vers le CA3 (Fig. 4d – i). Alors que l'amplitude maximale de l'EPSC et la latence d'apparition des EPSC EC-6b-CA3 étaient identiques à celles des EPSC PP-CA3 (Fig. 4j, k), le temps de montée de 20 à 80%, la constante de temps de décroissance et la durée étaient significativement plus lents. , et la dépression à court terme était presque absolue (Fig. 4l–o). De même, les potentiels post-synaptiques excitateurs EC-6b-CA3 (EPSP) ont une évolution lente, ressemblant aux potentiels de plateau décrits précédemment dans les neurones hippocampiques44 (Fig. 4p). D'autres enregistrements de courants et de potentiels évoqués optogénétiquement ont confirmé que les EPSC étaient sensibles à l'antagoniste AMPAR et KAR 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) sous un potentiel de maintien négatif (-60 mV) mais ce grand NMDAR des courants peuvent encore être observés sous un potentiel de maintien positif (+40 mV). Cela fournit une confirmation supplémentaire que ces courants sont principalement médiés par la libération de glutamate et que la cinétique lente n'est pas le résultat d'une activité polysynaptique, car celle-ci serait bloquée par CNQX (Fig. 4q – r et Supplémentaires Fig. 9a – f). Pris ensemble, ces résultats indiquent que les neurones EC-6b établissent une connexion synaptique glutamatergique unique et puissante avec les neurones pyramidaux CA3.

a – c Images représentatives de tranches d'hippocampe aigu suite à l'expression spécifique d'actionneurs optogénétiques (jaune) spécifiquement dans EC-6b (a), EC-2 (b) ou le DG (c) lors de l'enregistrement des réponses post-synaptiques des neurones dans CA3b (magenta). Le cercle en pointillé blanc indique la région ciblée pour la photostimulation et les barres d'échelle représentent 200 µm. d–f Traces représentatives individuelles (grises) et moyennées (noires) d'EPSC évoquées par optogénétique, suivant un train de 10 Hz d'impulsions lumineuses de 5 ms du 6b-CA3 (d), PP-CA3 (e) ou MF - Projections CA3 (f). g–i Dix réponses de tension superposées à la stimulation 6b-CA3 (g), PP-CA3 (h) ou MF-CA3 (i). j–o Graphiques récapitulatifs comparant les propriétés de l'EPSC pour chacune des voies : amplitude maximale de la première réponse (j), latence à l'apparition de l'EPSC depuis le début de la stimulation (k), temps de montée de 20 à 80 % (l), décroissance constante de temps (m), durée à mi-hauteur (n) et rapport d'impulsions appariées à 100 ms d'intervalle interstimulus (o). Les points de données individuels sont affichés sous forme de cercles ouverts et les barres indiquent la moyenne et le SEM pour chaque condition. Les schémas au-dessus des tracés illustrent la propriété EPSC mesurée indiquée dans chacun. p – r Réponses représentatives 6b-CA3 montrant des EPSP en forme de plateau avec un seul AP tronqué (p; gris, traces individuelles; noir, moyenne), EPSC enregistrés en présence de gabazine 100 μM et de CNQX 25 μM à un potentiel de maintien négatif ( q) et EPSC enregistrés en présence de 100 μM de gabazine, 25 μM de CNQX et 50 μM de D-AP5 à un potentiel de maintien positif (r). Nombre de mesures de chaque condition indiquée entre parenthèses dans la légende (voir k). Les tracés j–o montrent des points de données individuels, avec la moyenne et le SEM représentés par des lignes noires verticales et horizontales. Les différences statistiques avec P < 0,05 en utilisant le test bilatéral de Mann-Whitney (ajusté de Holm-Bonferroni) ont été considérées comme significatives. Les astérisques simples (*), doubles (**) et triples (***) indiquent P < 0,05, P < 0,01 et P < 0,001, respectivement.

Bien que l'existence d'une projection excitatrice capable de produire des potentiels postsynaptiques de type plateau n'ait pas été prédite, des modèles d'activité similaires se sont précédemment révélés suffisants pour la génération de nouveaux champs de lieu dans les neurones pyramidaux CA144,45, suggérant que la voie EC-6b pourrait jouent un rôle crucial dans le traitement de l'information spatiale (SI). Pour tester cette hypothèse, nous avons spécifiquement exprimé l'inhibiteur optogénétique ArchT dans les neurones de la couche 6b, en croisant la lignée conductrice Ctgf-2A-dgCre avec des souris rapporteurs Ai40, dans lesquelles ArchT-EGFP est conditionnellement exprimé (Fig. 5a). Nous avons ensuite implanté de manière chronique ces animaux avec une fibre optique au-dessus du SM CA1, ainsi que six tétrodes mobiles indépendamment dans la couche pyramidale CA1 (Fig. 10a supplémentaire). Nous nous sommes concentrés sur la région CA1, où nous nous attendions aux effets les plus importants de la manipulation expérimentale, car des effets directs via les synapses EC-6b-CA1 et des effets de réseau indirects (EC-6b–DG–CA3–CA1 et EC-6b–CA3–CA1) pourraient s'accumuler. Les animaux ont ensuite été placés dans une arène carrée et, après une session de familiarisation de 30 minutes (S1), laissés pour continuer l'exploration pendant 30 minutes supplémentaires avec la photoinhibition activée uniquement dans un quadrant attribué au hasard (S2). Cela a été suivi d'une troisième session de 30 minutes, au cours de laquelle encore une fois, aucune photoinhibition n'a été appliquée (S3) (Fig. 5b). Une analyse ultérieure du score SI des cellules pyramidales putatives a révélé que la photoinhibition entraînait une diminution aiguë du SI uniquement dans le quadrant manipulé pendant la séance de photoinhibition, qui était largement restaurée une fois la photoinhibition supprimée (quadrant cible : P = 1,02 × 10−23 ; reste de l'arène : P = 0,01 ; test de Mann-Whitney bilatéral, Fig. 5c). Cette diminution du SI ne pouvait être expliquée par aucun corrélat comportemental observable, tel que l'occupation ou la vitesse de déplacement, et de même n'était associée à aucun changement dans les propriétés de déclenchement de base des neurones excitateurs ou inhibiteurs dans la couche cellulaire pyramidale CA1 (Fig. 10b–j). Comme parmi tous les neurones projetant l'hippocampe, seule la couche EC 6b exprimait Ctgf (Fig. 8a – c supplémentaires), ces résultats indiquent que les neurones EC-6b régulent le codage spatial.

une section parasagittale représentative montrant l'expression spécifique d'ArchT-EGFP dans la couche 6b et l'emplacement de la fibre optique dans un Ctgf-2A-dgCre croisé avec une souris archT-EGFP (Ai40) cre reporter. b Tracés de position représentatifs pour les trois sessions d'exposition consécutives (en haut) et cartes de cadence de tir correspondantes de 12 unités représentatives, classées en fonction de leur score d'information spatiale en S3. Les nombres au-dessus de chaque tracé indiquent le taux de déclenchement maximal (Hz). c Un graphique récapitulatif montrant les informations spatiales moyennes pour les cellules pyramidales CA1 dans le quadrant éclairé (vert) par rapport au reste de l'arène (gris) dans chaque session d'exposition (à gauche) à côté d'un diagramme en boîte montrant le changement médian de SI entre S2- S1 et S3-S1 pour les cellules à l'intérieur et à l'extérieur de la région cible (à droite). Le centre de la boîte à moustaches, les limites de la boîte et des moustaches représentent la médiane, les 25e centiles supérieur et inférieur et les 10e centiles supérieur et inférieur, respectivement. Un total de 184 unités provenant de 4 animaux ont été inclus dans l'analyse. Les astérisques simples (*) et triples (***) indiquent P < 0,05 et P < 0,001, respectivement. d Images représentatives de l'hippocampe d'une souris Ctgf-2A-dgCre croisée avec une souris Rosa(stop)DTA, immunomarquée pour CPLX3, soit sans (en haut à gauche) soit 9 jours après l'administration de TMP (en haut à droite) avec des images STED représentatives tirées de le CA3 SM ci-dessous démontre la densité de VGluT1 et eCPLX3 à chaque instant. Les changements de densité de VGluT1 et eCPLX3/VGluT1 sont quantifiés pour CA1 et CA3 SM à différents moments après l'administration de TMP, chaque point représentant un animal individuel (n = 3 animaux par groupe) et les lignes représentent la moyenne pour chaque condition ( tracé du bas). e Schéma de principe du protocole expérimental dans l'intellicage. f Diagramme temporel du taux d'erreur moyen du groupe pendant chacun des jours expérimentaux. Le TMP a été administré au jour expérimental 0, indiqué par une flèche noire. g Nuage de points entre la densité des terminaux eCPLX3 survivants dans le CA3 SM, calculée à partir des images STED, et le taux d'erreur pour chaque animal du groupe TMP, aux jours expérimentaux 8 et 9, correspondant au dernier jour du nouvel emplacement final ( D) et le premier jour du retour au lieu familier (A*), respectivement. Coefficient de corrélation de rang de Spearman unilatéral (rs) avec sa valeur P correspondante indiquée ci-dessous et les lignes de régression en pointillés indiquées pour chaque groupe. Les données en (c, à gauche) et f sont affichées sous forme de moyenne et SEM et les barres d'échelle sur les images représentent 200 µm.

Sur la base de ces résultats, nous avons émis l'hypothèse que cette nouvelle voie synaptique pourrait être tout aussi importante dans la médiation de la formation et de la rétention de la mémoire spatiale. Pour répondre à cette question, nous avons croisé des souris Ctgf-2A-dgCre avec des souris RosaStopDTA, afin de permettre une ablation conditionnelle sélective de la population EC-6b dans le cerveau adulte, tout en épargnant toutes les autres projections hippocampiques excitatrices à longue portée (Fig. 5d et Supplémentaire Fig. 8a–c). Les animaux doublement transgéniques ont ensuite été co-hébergés dans un environnement d'intellicage46, ce qui nous a permis de contrôler à distance l'emplacement de la disponibilité de l'eau pour chaque animal individuellement et de surveiller son comportement d'exploration. Après une période d'accoutumance, nous avons attribué à chaque animal un orifice spécifique (Fig. 5e; "A") où il pouvait avoir un accès illimité à l'eau et 5 jours plus tard, nous avons injecté aux animaux soit du TMP, pour induire une ablation spécifique de la couche 6b, soit avec une solution de véhicule. Immédiatement après cette manipulation, nous avons assigné chaque animal à un port d'eau différent, symétriquement tourné vers un coin et un côté différents pendant une période de 3 jours. Au total, ce processus a été répété trois fois (Fig. 5e ; "B", "C" et "D") avant de réaffecter les animaux au port d'origine, dont ils ont appris l'emplacement avant la manipulation (Fig. 5e, " UN*"). Nous avons constaté que la capacité des animaux EC-6b-ablés à apprendre de nouveaux emplacements de récompense était altérée ("D" contre "A"), à un rythme qui suivait de près celui du processus d'ablation (Fig. 5d). De manière inattendue, ces souris ont également rencontré des difficultés pour oublier l'emplacement qu'elles avaient appris juste avant la manipulation ("A*" contre "A").

L'analyse ANOVA à trois voies avec transformation alignée des rangs a révélé des effets significatifs de la session et du jour expérimental, et a en outre démontré une interaction hautement significative entre le groupe (TMP par rapport au véhicule) et la session (A, D, A * ; P = 1,3 × 10−4), indiquant que l'ablation cellulaire affectait de manière significative mais différentielle l'apprentissage lors de sessions nouvelles et familières (Fig. 5e). Dans la nouvelle session "D" et la session familière "A*", les animaux ayant subi une ablation EC-6b ont montré un apprentissage réduit ("D": TMP, P = 0,036 contre Veh, P = 1,8 × 10−4 ; "A*": TMP, P = 0,116 contre Veh, P = 2,2 × 10−4). Étant donné que les effets chez les animaux individuels étaient variables, nous avons émis l'hypothèse que la performance des animaux serait en corrélation avec le degré d'ablation. Pour tester cette hypothèse, nous avons tracé le taux d'erreur individuel aux jours 8 et 9 du test comportemental, correspondant au dernier jour du troisième nouveau port et au premier jour après le retour au port familier, en fonction du degré d'ablation de la couche 6b, mesuré par la densité des terminaux eCPLX3 restants par rapport à la densité totale de VGluT1 dans le CA3 (Fig. 5g). Nous avons constaté que l'acquisition de nouveaux souvenirs spatiaux était significativement corrélée à la densité d'eCPLX3, alors que pour la rétention de souvenirs précédemment acquis, il y avait une tendance dans la direction opposée (Fig. 5g ; rs = −0,91, P = 3 × 10−5 versus rs = 0,46, P = 0,11). Ainsi, les animaux avec l'ablation la plus sévère étaient ceux avec les moins bonnes performances au jour 8, et les meilleures performances au jour 9, et vice versa. Ces résultats confirment l'implication d'EC-6b à la fois dans la formation de nouvelles mémoires spatiales et dans la rétention d'anciennes mémoires spatiales.

Nos résultats démontrent que les neurones de la couche entorhinale la plus profonde, correspondant au profil moléculaire21,22,23, morphologique26,27 et électrophysiologique47 de la couche corticale 6b, se projettent sur toutes les sous-régions hippocampiques et probablement parahippocampiques, tout en présentant le modèle de connectivité bidirectionnelle caractéristique. avec des noyaux thalamiques, précédemment rapportés pour les SPN dans le cerveau néonatal26,48,49,50 (Figs. 1–3 et Figs. Supplémentaires 1, 2). Ainsi, plusieurs sources de données suggèrent que les neurones EC-6b projetant l'hippocampe que nous avons identifiés dans le cerveau adulte correspondent à une population persistante de SPN. Il s'agit d'une découverte inattendue, non seulement parce que l'existence de telles cellules dans l'EC n'avait pas été signalée auparavant, mais plus encore parce que les couches plus profondes sont censées traiter et redistribuer sélectivement la sortie de l'hippocampe2,3.

Les SPN sont les premiers neurones générés au cours du développement embryonnaire, à E11.5-E12.529 et il est largement admis qu'ils jouent un rôle de premier plan dans divers processus associés au développement cortical, tels que la migration cellulaire, la différenciation et le câblage des couches corticales24 ,51,52,53. Conformément à cette fonction proposée, il est largement admis que les SPN meurent peu de temps après la fin de la corticogenèse, vraisemblablement par mort cellulaire programmée24,25,54. Cependant, il existe de plus en plus de preuves que des sous-populations de SPN, de préférence celles exprimant Cplx3 et Ctgf, persistent à l'âge adulte18,22,26,55, et nos résultats confirment et étendent ces découvertes précédentes. La contribution des SPN au développement cortical et de la couche 6b à la dynamique des circuits chez l'adulte peut ne pas être mutuellement exclusive et il sera intéressant d'examiner les interactions possibles entre les deux processus à l'avenir.

Depuis le travail classique de Santiago Ramón y Cajal56, le circuit EC-hippocampe est souvent considéré comme une boucle trisynaptique, dans laquelle les principaux éléments du circuit sont connectés linéairement. Bien que des ajouts mineurs aient été apportés, le schéma de connectivité de base est resté incontesté5. Nos résultats identifient une nouvelle connexion dans ce circuit bien établi. Bien que le nombre de neurones EC-6b soit bien inférieur à celui des neurones EC-2/3, des propriétés fonctionnelles et structurelles uniques convergent pour doter ces neurones d'une influence disproportionnée par rapport à leur nombre. Premièrement, l'EPSC montre une décroissance lente et une dépression synaptique absolue, conduisant à des EPSP en forme de plateau dans les cellules cibles postsynaptiques, dont l'apparition est chronométrée au premier événement de pointe dans une rafale donnée (Fig. 4d, p). Deuxièmement, les neurones EC-6b reçoivent une entrée convergente de plusieurs sources, notamment le claustrum - un hub cortical central et hautement interconnecté57 (Fig. 3), et ciblent toutes les sous-régions comprenant le HF (Fig. 1d). Enfin, un degré élevé d'interconnectivité entre les SPN, médié par les synapses chimiques et électriques, observé dans le cortex en développement53,58,59 pourrait persister à l'âge adulte, permettant à un petit nombre de SPN interconnectés de synchroniser l'activité dans les sous-régions cortico-hippocampiques. Prises ensemble, ces propriétés uniques peuvent expliquer le rôle puissant de ces neurones dans le comportement et suggérer une fonction uniformément importante à travers la plaque corticale.

Plusieurs mécanismes peuvent expliquer la lente désintégration des EPSC EC-6b-CA3. Il est possible que la cinétique des récepteurs du glutamate contribue à l'évolution lente, bien que les différentes cinétiques des entrées EC-2 et EC-6b, qui se terminent sur les dendrites distales des mêmes types de cellules, puissent s'opposer à cette possibilité. Alternativement, la libération asynchrone de l'émetteur, le débordement de l'émetteur et la transmission du volume pourraient jouer un rôle. Il est intéressant de noter que les neurones EC-6b présentent des similitudes avec les cellules neurogliaformes GABAergiques Ndnf+37, notamment en ce qui concerne l'évolution lente des événements synaptiques60 et l'expression de la protéine synaptique CPLX3, qui n'est exprimée dans aucun autre type de cellule corticale (Fig. 4). Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour comparer les deux types de synapses au niveau unitaire.

Nos résultats suggèrent que EC-6b contribue au codage spatial et à la formation de la mémoire dans l'hippocampe. Le silençage optogénétique aigu des neurones EC-6b profonds a entraîné une diminution aiguë du SI des neurones pyramidaux CA1 (Fig. 5a – c), avec seulement une réduction minime de la fréquence de déclenchement moyenne (Fig. 10 supplémentaire). Ainsi, les effets de l'inhibition optogénétique diffèrent de ceux observés suite à une manipulation aiguë ou chronique des neurones EC de la couche superficielle, qui n'ont jusqu'à présent entraîné que des modifications mineures du SI6,7,8,9,10,11. De plus, les effets diffèrent également de ceux de l'inhibition optogénétique aiguë de la projection CA3-CA1, qui entraîne une diminution marquée des taux de déclenchement, mais une augmentation du SI dans les neurones pyramidaux CA161. Il est possible que la sortie divergente des neurones de la couche 6b affecte la cohérence des pics dans le réseau hippocampique, contribuant à la synchronisation des neurones principaux dans la gamme de fréquences delta lente (0,5–3 Hz) et thêta (3–8 Hz). Selon ce modèle, des schémas de déclenchement spécifiques à un lieu pourraient apparaître et se stabiliser à la suite d'une activation faible mais hautement orchestrée des réseaux, couvrant toutes les sous-régions de l'hippocampe. Dans le CA1, il a été démontré que des potentiels de plateau tels que ceux que nous avons observés après la stimulation de la projection EC-6b vers CA3 sous-tendent la formation de champs de lieu44,45 et, plus récemment, de mémoires associatives62, apportant un soutien supplémentaire à cette hypothèse. Des enregistrements multi-unités de EC-6b ont précédemment montré que des sous-ensembles de cellules présentaient des schémas de tir en forme de grille17. Ainsi, la connexion de la couche 6b à l'hippocampe peut fournir une explication aux observations précédentes selon lesquelles des champs de lieu hippocampiques peuvent survenir avant et en l'absence de l'activité des cellules de la grille EC-2.

Pour étudier la contribution des neurones EC-6b à la formation de la mémoire spatiale, nous avons conçu une expérience utilisant le système intellicage, qui nous permet de contrôler simultanément et différemment l'emplacement d'une récompense en eau pour une cohorte d'animaux co-hébergés, dans leur cage d'origine. et sans la présence physique d'un expérimentateur. Cette conception, qui imite quelque peu la situation dans un habitat naturel, a révélé un double effet de l'ablation de la couche 6b sur la mémoire spatiale : alors que l'ablation altérait la capacité d'apprendre de nouveaux emplacements de récompense, elle affectait également la capacité d'oublier les emplacements précédents.

La manipulation utilisée pour cibler les neurones EC-6b a été efficace pour maximiser le nombre de cellules affectées dans cette couche, nous permettant ainsi d'observer des effets robustes dans une tâche comportementale. Cependant, étant donné que la manipulation n'était pas spécifique à l'EC, l'ablation des neurones de la couche 6b dans d'autres zones corticales peut également avoir été impliquée. Bien que des déficits moteurs ou sensoriels puissent être exclus, car ils entraîneraient une diminution indépendante de la localisation des performances comportementales, des effets de réseau plus complexes au-delà de la CE ne peuvent être exclus. Celles-ci pourraient provenir d'altérations de l'activité dans le cortex préfrontal, dont il a déjà été démontré qu'il était impliqué dans des tâches spatiales nécessitant une flexibilité cognitive65,66 (mais voir également la réf. 67). Cependant, comme la tâche comportementale a une composante spatiale majeure, qui implique probablement l'axe EC-hippocampe, l'explication la plus parcimonieuse est que les neurones de la couche entorhinale 6b jouent un rôle essentiel dans ces effets comportementaux. Même dans le scénario improbable où il sera démontré que les effets comportementaux observés ne nécessitent que le cortex préfrontal, sans implication de la formation hippocampique, nos résultats devraient toujours être pertinents car, à ce jour, aucune fonction comportementale ou cognitive n'a été attribuée aux cellules. de la couche 6b dans n'importe quelle région corticale.

Bien que cet effet bidirectionnel puisse sembler paradoxal, il a été suggéré que la dégradation de la mémoire est un processus mnémonique actif et tout aussi adaptatif que l'encodage de la mémoire et qu'une capacité réduite à oublier devrait également être considérée comme un déficit de la mémoire68. Ces découvertes soulèvent la possibilité intéressante que ces deux processus opposés ne soient pas seulement liés mais résultent de modèles d'activité d'une seule population de neurones, capables à la fois de synchroniser, mais aussi de désynchroniser l'activité dans les circuits hippocampiques.

Nous concluons que les neurones entorhinaux de la couche 6b sont essentiels au bon fonctionnement de l'hippocampe des rongeurs adultes, y compris le codage spatial et la mémoire. Les neurones de la couche 6b dans d'autres régions corticales peuvent avoir des fonctions similaires, ce qui implique un rôle général dans les calculs de réseau complexes à l'échelle du cerveau. Comme la couche de sous-plaque est hautement conservée dans toutes les espèces de mammifères et semble être la plus développée dans le cerveau humain69,70,71, nos résultats pourraient potentiellement être extrapolés au-delà de l'organisme modèle. Les travaux futurs identifieront la contribution des neurones de la couche 6b aux fonctions des circuits supérieurs du cerveau humain dans la santé et la maladie.

Les cellules HEK293-GT et BHK-eT ont été utilisées pour récupérer, pseudotyper et amplifier les vecteurs viraux de la rage RVdG-CVS-N2c sur la base d'une approche publiée précédemment12. En bref, des cellules HEK293-GT exprimant de manière stable la glycoprotéine optimisée SAD B19 et une ARN polymérase T7 optimisée ont été transfectées avec le plasmide vecteur RVdG-CVS-N2c ainsi que les plasmides auxiliaires SADB19 pTIT-N, pTIT-P et pTIT-L à l'aide de polyéthylèneimine. (Î.-P.-É.). Une fois que toutes les cellules de la culture ont été marquées par fluorescence, généralement 5 à 6 jours après la transfection et 1 à 2 jours à partir du moment où la fluorescence a été détectée pour la première fois, le milieu a été récolté, filtré, aliquoté et une petite quantité (100 à 200 µl ) a été transféré dans des boîtes contenant des cellules BHK-eT, qui expriment de manière stable la glycoprotéine envA et le récepteur TVA, pour un pseudotypage et une amplification simultanés des vecteurs. Les vecteurs pseudotypés ont été collectés quotidiennement pendant une période de trois jours, à partir du jour 3 de la transduction et le virus a été regroupé et centrifugé à 70 000 × g pendant 1,5 h. Après centrifugation, le milieu a été aspiré et le culot viral a été remis en suspension dans 200 µl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7, 4, aliquoté et stocké à -80 ° C jusqu'à utilisation. Le titre final des vecteurs viraux de la rage RVdG-CVS-N2c pseudotypés a été déterminé à l'aide de la transduction en série de HEK293-TVA et calculé à l'aide d'une formule publiée précédemment72. Pour une liste complète des plasmides RVdG-CVS-N2c utilisés dans cette étude, voir le tableau supplémentaire 2.

La production d'AAV a été réalisée dans des cellules HEK293T sur la base d'un protocole publié précédemment73. En bref, des cellules HEK293 entièrement confluentes ont été transfectées avec un plasmide vecteur AAV2 avec pAdenoHelper et les plasmides AAV-dj RepCap en utilisant PEI. Trente-six heures après la transfection, les cellules ont été récoltées, culottées et lysées en utilisant trois cycles de congélation-décongélation. Les cellules lysées ont été incubées avec de la benzonase-nucléase (Sigma-Aldrich) pendant 1 h, puis les débris ont été culottés et le surnageant contenant le virus a été collecté et passé à travers un filtre de 0, 22 µm. Le surnageant collecté a ensuite été mélangé avec une quantité égale d'héparine-agarose (Sigma-Aldrich) et maintenu à 4 ° C pendant la nuit avec une agitation constante. Le lendemain, le mélange agarose-virus a été transféré sur une colonne de chromatographie et l'agarose a été laissé décanter. Le surnageant a ensuite été drainé de la colonne par gravité et le virus lié à l'agarose a été lavé une fois avec du PBS puis élué avec du PBS additionné de 0,5 M de NaCl. Le virus élué a ensuite été filtré à nouveau, dessalé et concentré à l'aide d'un filtre centrifuge de 100 kDa, puis aliquoté et stocké à -80 ° C jusqu'à son utilisation. Pour une liste complète des plasmides AAV utilisés dans cette étude, voir le tableau supplémentaire 2.

Toutes les lignées de souris transgéniques utilisées dans cette étude ont été préalablement caractérisées (tableau supplémentaire 3). Dans toutes les expériences, des souris mâles et femelles ont été utilisées de manière interchangeable en quantités égales, dans une tranche d'âge qui variait entre 1 et 6 mois. Dans les expériences comportementales, des effets légèrement plus importants du TMP chez les femelles ont été notés, probablement en raison d'un effet plus robuste du TMP, mais cette observation n'a pas été approfondie. Des expériences sur des souris C57BL/6 de type sauvage et transgéniques ont été réalisées en stricte conformité avec les directives institutionnelles, nationales et européennes pour l'expérimentation animale et ont été approuvées par le Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft et Bildung, Wissenschaft und Forschung, respectivement, d'Autriche (A. Haslinger, Vienne ; BMWF-66.018/0010-WF/V/3b/2015 ; BMBWF-66.018/0008-WF/V/3b/2018).

Pour la délivrance in vivo de vecteurs viraux, les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane, injectées avec de la buprénorphine 0,1 mg kg-1 et placées dans un cadre stéréotaxique où elles ont continué à recevoir 1 à 5 % d'isoflurane vaporisé dans de l'oxygène à un débit fixe de 1 l min−1. Les réflexes de retrait des jambes ont été testés pour évaluer la profondeur de l'anesthésie et lorsqu'aucun réflexe n'a été observé, une incision a été pratiquée sur le cuir chevelu pour exposer le crâne. Bregma a ensuite été localisé et ses coordonnées utilisées comme référence pour les coordonnées antéro-postérieures (AP) et médio-latérales (ML), tandis que la surface de la dure-mère au site d'injection a été utilisée comme référence pour les coordonnées dorso-ventrales (DV). Dans nos expérimentations, nous avons utilisé les ensembles suivants de coordonnées AP/ML/DV (en mm) : DG : -1,9/1,3/-1,9 ; CA3 : -1,9/±2,5/-2 ; CA1 : -1,9/1,5/-1,2 ; IN de l'hippocampe : -1,9/1,8/-1,6 ; CE : -4/3,5/-3. Les vecteurs AAV ont d'abord été dilués à 1:5 dans du PBS et délivrés au site d'injection à un volume de 0,3 µl et à un débit de 0,06 µl par minute, en utilisant une seringue Hamilton et une aiguille 32G. Une fois l'injection terminée, l'aiguille a été laissée en place pendant 1 à 2 minutes supplémentaires pour permettre au virus de se diffuser dans les tissus, puis s'est lentement rétractée. À la fin de la séance d'injection, le cuir chevelu a été recollé et les souris ont été renvoyées dans leur cage d'origine pour récupérer. L'injection de vecteurs viraux pseudotypés de la rage a eu lieu 2 à 3 semaines après l'injection initiale de vecteurs AAV contenant le récepteur TVA et la glycoprotéine de la rage. Les vecteurs pseudotypés de la rage ont d'abord été dilués pour atteindre une concentration finale d'environ 2 à 5 × 108 UT ml-1, puis injectés de la même manière que l'AAV. À l'exception des injections de rage dans le DG de Prox1-cre ou EC d'animaux transgéniques Ctgf-2A-dgCre, toutes les autres injections de virus de la rage ont été décalées de -0,2 mm AP et de -0,2 mm ML. Cela a été fait afin d'éviter, autant que possible, un marquage non spécifique le long du trajet de l'aiguille de la première injection, en raison du manque de spécificité complète de l'expression de la Cre-recombinase dans les transgéniques KA1-cre et DLX5/6-Flp. lignes.

Des enregistrements électrophysiologiques à partir de cellules identifiées rétrogradement marquées ont été effectués 5 à 7 jours après l'injection de vecteurs CVS-N2c. Les animaux manipulés ont été anesthésiés à l'aide d'un mélange de MMF composé de médétomidine (0,5 mg kg-1), de midazolam (5 mg kg-1) et de fentanyl (0,05 mg kg-1) et perfusés par voie transcardiaque avec 20 ml de solution de dissection glacée contenant 87 mM NaCl, NaHCO3 25 mM, KCl 2,5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glucose 10 mM, saccharose 75 mM, CaCl2 0,5 mM et MgCl2 7 mM (pH 7,4 dans 95 % O2/5 % CO2, 325–327 mOsm). Le cerveau a ensuite été retiré et l'hippocampe ainsi que le tissu cortical adjacent ont été disséqués et placés dans un moule préfabriqué en agarose à 4% conçu pour stabiliser le tissu. Le moule a été transféré dans la chambre d'un vibratome VT1200 (Leica Microsystems) et le tissu a été sectionné transversalement en tranches de 350 µm d'épaisseur en présence d'une solution de section glacée. Les tranches cortico-hippocampiques transversales ont été laissées récupérer pendant environ 30 min à environ 31 ° C, puis conservées à température ambiante (RT, 22 ± 1 ° C) pendant la durée des expériences. Pendant les enregistrements, les tranches ont été superfusées avec une solution d'enregistrement contenant 125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 25 mM de NaHCO3, 1,25 mM de NaH2PO4, 25 mM de D-glucose, 2 mM de CaCl2 et 1 mM de MgCl2 (pH 7,4 dans 95 % d'O2/5 % CO2, 316 mOsm), à un débit de ~1 ml min−1 en utilisant un écoulement par gravité. Les neurones dans les régions d'intérêt ont été patchés à l'aide de pipettes de patch tirées contenant : 125 mM de K-gluconate, 20 mM de KCl, 0,1 mM d'EGTA, 10 mM de phosphocréatine, 2 mM de MgCl2, 2 mM de Na2ATP, 0,4 mM de Na2GTP, 10 mM d'HEPES (pH ajusté à 7,28 avec KOH, ~300 mOsm) ; 0,3 % de biocytine a été ajouté dans un sous-ensemble d'enregistrements. Les cellules patchées ont été maintenues en mode pince de courant au potentiel de membrane au repos du neurone. Les signaux des cellules patchées ont été acquis à l'aide d'un amplificateur Axon Axopatch 200 A (Molecular Devices) et numérisés à l'aide d'un convertisseur analogique-numérique CED Power 1401 (Cambridge Electronic Design). La stimulation optogénétique a été délivrée à l'aide d'une LED blanche filtrée en bleu à une intensité de 4, 5 mW mm -2 (Prizmatix, IL), passée à travers un objectif × 63 positionné au-dessus du neurone enregistré. Pour tous les enregistrements, 2 à 5 impulsions lumineuses d'une durée de 5 ms ont été délivrées à une fréquence de 10 Hz, avec un intervalle de 20 s entre les stimulations. Pour l'isolement des courants médiés par les récepteurs AMPA et NMDA, nous avons utilisé une solution interne à base de CsCl composée de 145 mM CsCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 5 mM phosphocréatine 2 mM Na2ATP, 0,3 mM Na2GTP et 5 mM QX-314 (pH ajusté à 7,28 avec KOH, ∼310 mOsm), ainsi que les agents pharmacologiques suivants : 100 µM Gabazine, 25 µM CNQX et 50 µM D-AP5 appliqués à différentes étapes de l'enregistrement. À la fin de chaque session d'enregistrement, l'électrode a été lentement rétractée pour former un patch extérieur-extérieur. Par la suite, la tranche a été retirée de la chambre d'enregistrement, immergée dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 %, puis conservée dans un tampon phosphate (PB) 0,1 M jusqu'à un traitement ultérieur. Des analyses ultérieures des propriétés de l'EPSC et de la membrane ont été effectuées à l'aide de Stimfit (version 0.15.8 ; https://github.com/neurodroid/stimfit)74 et des traces représentatives ont été traitées et visualisées à l'aide d'Igor Pro 6 (Wavemetrics, OR, USA).

À des fins d'imagerie, les animaux ont été sacrifiés 5 à 7 jours après l'injection des vecteurs RVdGenvA-CVS-N2c. Tout d'abord, les animaux ont été anesthésiés comme décrit dans la section précédente et perfusés par voie transcardiaque avec 15 ml de PB 0,1 M suivi de 30 ml de PFA à 4 %. Après la perfusion, le cerveau a été retiré et conservé dans du PFA à 4 % pendant une nuit à 4 °C, qui a ensuite été remplacé par du PB 0,1 M. Les cerveaux fixes ont été sectionnés à 100 µm d'épaisseur dans un plan coronal, parasagittal ou transversal et stockés dans du PB 0,1 M à 4 °C.

Pour le marquage immunohistochimique du tissu transduit, des protocoles standard ont été utilisés. Tout d'abord, les sections ont été lavées avec du PB 3 fois pendant 10 min. Ensuite, les coupes ont été incubées avec 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) et 0,3 % de Triton X-100 pendant 1 h, à température ambiante avec agitation constante, puis avec des anticorps de lapin contre CPLX3 (Synaptic Systems, Cat#122 302, 1:500) , dans du PB contenant 5 % de NGS et 0,3 % de Triton X-100, à 4 °C pendant la nuit. Après lavage, les tranches ont été incubées avec des anticorps secondaires spécifiques à l'isotype (chèvre anti-lapin conjugué avec Alexa Fluor 488 ou 647) dans du PB contenant 5 % de NGS et 0,3 % de Triton X-100 pendant 2 h à température ambiante avec agitation constante. Après un nouveau lavage, les tranches ont été montées, incorporées dans le milieu de montage Prolong Gold Antifade (Thermo-Fisher Scientific, Cat # P36930) scellé avec une lamelle de 0,17 mm. Pour le double marquage de CPLX3 avec VGLUT1 ou VGAT, des anticorps de cobaye ont été utilisés (Synaptic Systems, Cat# 135304 et 131004, respectivement, 1:200) et pour le marquage de PCP4 et NeuN, des anticorps de lapin ont été utilisés (Novus Biologicals, Cat# NBP1-80929 et NBP1-92693 respectivement, 1:500). Pour l'acquisition des images STED, nous avons utilisé des anticorps secondaires anti-lapin Star580 et anti-cobaye Star635P (Abberior, Allemagne, 1:200).

Les neurones remplis de biocytine (0,3 %) ont été traités pour une analyse morphologique. Après le retrait des pipettes, entraînant la formation de patchs extérieurs aux extrémités des pipettes, les tranches ont été fixées pendant 12 à 24 h à 4 ° C dans une solution de PB 0, 1 M contenant 4% de PFA. Pour la reconstruction de la morphologie dendritique, des tranches fixes ont été traitées avec de la strepdavidine conjuguée à l'Alexa-Fluor 647 (Invitrogen, Cat# S32357 : 1:200) avec 5 % de NGS et 0,4 % de Triton X-100 pendant environ 2 h, suivi de 3 cycles de lavage en PB. Les coupes colorées ont ensuite été montées sur une lame, incluses dans du Mowiol (Sigma-Aldrich) et scellées avec une lamelle de 0,17 mm.

Une souris adulte de type sauvage (P60) a été euthanasiée par décapitation et son cerveau a été rapidement retiré, fixé dans du PFA froid à 4 % pendant 4 h, suivi d'une incubation supplémentaire de 24 h dans une solution froide de saccharose à 30 %. Ensuite, le cerveau a été inclus dans un composé à température de coupe optimale (OCT, Tissue-Tek), congelé avec de la neige carbonique et tranché en sections de 16 µm avec un cryostat (Leica CM1950, Leica Biosystems). Tout d'abord, les sections ont été fixées avec du PFA à 4 % pendant 15 min, lavées avec du PBS et déshydratées à l'aide d'un gradient EtOH ascendant (25 %, 50 %, 75 % et 100 %, chaque étape pendant 5 min avec séchage ultérieur pendant 15 min) . Les tranches ont ensuite été colorées selon le protocole du fabricant75 (Molecular Instruments), avec du DAPI complété avant le montage. Les sondes ISH pour la détection de Cplx3 et Ctgf (également appelées Ccn2) ont été conçues commercialement par le fabricant.

Les images confocales ont été acquises à l'aide d'un microscope LSM 800 (Zeiss). Un sous-ensemble d'échantillons de tissus nettoyés a été acquis à l'aide du microscope confocal à disque rotatif Andor Dragonfly (technologies Andor). Toutes les images confocales représentatives affichées dans ce manuscrit sont présentées sous la forme d'une projection d'intensité maximale d'une pile d'images de 4 à 12 images distinctes. Pour l'imagerie du tissu intact, la plaque corticale, contenant l'hippocampe et l'EC adjacent, a été retirée de l'hémisphère transduit puis dégagée à l'aide de la méthode CUBIC76. Une fois que le tissu est apparu translucide, il a été monté dans une chambre toujours immergée dans la solution CUBIC, légèrement pressé afin d'aplatir le tissu, et surmonté d'une lamelle. Le tissu nettoyé a ensuite été transféré au microscope confocal avec le côté CA3 vers le haut, où il a été imagé pendant la nuit. Pour toutes les images utilisées dans ce manuscrit, une éventuelle diaphonie entre les canaux a été étroitement surveillée et a été exclue avant l'analyse du chevauchement des signaux.

La microscopie STED bicolore a été réalisée sur un microscope STED inversé commercial (Abberior Instruments, Allemagne) avec une excitation pulsée et des lasers STED. Un laser de 561 nm et un laser de 640 nm ont été utilisés pour l'excitation et un laser de 775 nm pour l'épuisement de l'émission stimulée. Un objectif à immersion dans l'huile avec une ouverture numérique de 1,4 (UPLSAPO 100XO, Olympus, Japon) a été utilisé pour l'acquisition d'images. Le signal de fluorescence a été collecté dans un arrangement confocal avec une taille de trou d'épingle de 0, 6 unités aérées à l'aide de photodiodes à avalanche à comptage de photons avec des filtres passe-bande 605/50 nm et 685/70 nm pour la détection STAR 580 ou STAR 635P, respectivement. Le taux de répétition des impulsions était de 40 MHz et la détection de la fluorescence était temporisée. Les paramètres d'imagerie utilisés pour l'acquisition d'images STED bicolores étaient un temps de séjour des pixels de 15 μs, une puissance laser d'excitation d'environ 4, 5 μW (561 nm) et d'environ 3, 8 μW (640 nm) et une puissance laser STED d'environ 75 mW. Les canaux ont été acquis consécutivement en pas de ligne avec des accumulations sur deux lignes pour chaque canal. Pour les images tricolores, la même région d'intérêt a été enregistrée avec un troisième canal de couleur avec une résolution limitée par la diffraction à l'aide d'un laser de 488 nm avec un temps de séjour de 25 μs et une puissance d'excitation d'environ 40 μW. Ici, une taille de trou d'épingle de 1,0 unité aérée et des accumulations à 2 lignes ont été utilisées. Le signal a été collecté à l'aide d'une photodiode à avalanche à comptage de photons avec un filtre passe-bande 525/50 nm. La taille des pixels était de 40 nm pour toutes les images. Les valeurs de puissance se réfèrent à la puissance à l'ouverture arrière de l'objectif. Des images de l'hippocampe SM ont été prises à partir des régions correspondant aux projections de la MEC, c'est-à-dire la couche moléculaire médiale du DG, CA3 et CA2, la couche moléculaire proximale du CA1 et la SM distale du subiculum.

La quantification du nombre de cellules dans la préparation de tissu nettoyée, ainsi que la quantification de la colocalisation dans des sections minces, a été réalisée à l'aide du logiciel Imaris (Oxford Instruments) avec une distance maximale pour la colocalisation fixée à 2 µm. L'analyse de la colocalisation des terminaux pour les images STED a été réalisée à l'aide de Fidji ("Fiji is just ImageJ")77 via un script écrit sur mesure (https://github.com/sommerc/coloco3surf). À cette fin, un masque a été créé pour chacun des canaux individuels après un réglage manuel du seuil, avec des surfaces inférieures à 0,1 µm2 rejetées. La densité de signal pour chaque canal a ensuite été calculée comme le rapport entre le nombre total de pixels dans le masque et le nombre total de pixels dans l'image. Ensuite, un nouveau masque, qui ne contenait que des pixels se chevauchant des deux canaux, a été créé, avec des surfaces inférieures à 0,1 µm2 à nouveau rejetées et la densité calculée comme décrit pour les masques primaires.

Des souris Ctgf-2A-dgCre//Ai40 ont reçu 150 mg kg-1 de TMP afin de piloter l'expression d'ArchT-GFP dans les neurones EC-6b. 2 à 3 jours après l'induction de Cre, les animaux ont été implantés avec 6 tétrodes indépendamment mobiles, entourant une fibre optique (diamètre de noyau de 240 μm, 0,63 NA, pointe conique à 45 ° ; lentilles doriques), sous anesthésie profonde à l'aide d'isoflurane (0,5 à 3 % ), de l'oxygène (1–2 l min−1) et une dose initiale de buprénorphine (0,1 mg kg−1). Les tétrodes ont été construites à partir de quatre fils de tungstène de 12 μm en conséquence (isolation H-Formvar avec couche de liaison Butyral, California Fine Wire, Grover Beach CA), torsadés, puis chauffés afin de les lier en un seul faisceau. Les pointes ont ensuite été plaquées or pour réduire leur impédance d'électrode à 200–400 kΩ. Pendant la chirurgie, une craniotomie a été centrée au-dessus du CA1 dorsal et la pointe de la fibre optique a été implantée aux coordonnées suivantes : -1,9 mm AP et 1,6 mm ML du bregma et -1,2 mm de la surface piale. Les pointes des tétrodes étaient initialement positionnées à environ 300 µm au-dessus de la pointe de la fibre. Deux vis positionnées au-dessus du cervelet servaient d'électrodes de masse et de référence. Deux vis d'ancrage supplémentaires en acier inoxydable ont été utilisées pour fixer de manière permanente l'ensemble microdrive au crâne. Les électrodes enduites de cire de paraffine et l'appareil de microentraînement ont ensuite été enduits d'acrylique dentaire pour envelopper l'ensemble électrode-microentraînement et l'ancrer aux vis dans le crâne. Après une période de récupération de 7 jours, les tétrodes ont été abaissées par pas de 50 à 150 μm chaque jour dans la région CA1 sur une nouvelle période de 7 à 14 jours.

Les données extracellulaires ont été acquises à l'aide du système d'évaluation Intan RHD2000 et d'un headstage RHD2132 (Intan Technologies, CA, USA) avec une version étendue du logiciel Ktan (https://git.ist.ac.at/alois.schloegl/ktan. git). Le signal électrique a été échantillonné à 20 kHz. La trajectoire a été suivie avec une caméra vidéo (FL-HC0614-2M; RICOH) enregistrant deux lumières LED fixées au headstage et enregistrées à l'aide du logiciel Positrack (https://github.com/kevin-allen/positrack). L'extraction de pointes a été réalisée en mettant en œuvre le logiciel Mountainsort78 et un logiciel personnalisé a été utilisé pour le nettoyage et le raffinement des clusters (https://github.com/igridchyn/lfp_online). Le feu vert pour l'activation d'ArchT a été fourni par une LED verte de 535 nm à 2, 5 mW mm -2 (Prizmatix, IL). La source lumineuse a été couplée à un cordon de raccordement à fibre optique de 0,48 NA (4,5 m de long, 0,37 NA; lentilles doriques), qui a transmis la lumière au microdrive. Les impulsions lumineuses ont été déclenchées avec des impulsions TTL envoyées via le port parallèle de l'ordinateur, exécutant le logiciel d'acquisition et de décodage de signal en temps réel.

Pour l'analyse des données, l'environnement de champ ouvert a été divisé en 15 × 15 compartiments spatiaux de taille égale d'environ 11,1 cm2 chacun. À l'aide du suivi de position, une carte d'occupation a été générée en calculant le temps passé par l'animal dans chaque case spatiale pendant les périodes de course (filtre de vitesse > 3 cm s−1). Ensuite, le nombre de pointes qu'une cellule a déclenchées dans chaque bac spatial a été compté (également filtré par vitesse,> 3 cm s-1) et divisé par le temps d'occupation. Les cartes de taux ont ensuite été lissées avec un filtre gaussien avec un écart type de 1 bin. Pour mesurer le réglage spatial des cellules, la mesure SI a été calculée79. Seules les cellules avec un taux de déclenchement moyen entre 0,2 et 5 Hz ont été incluses dans cette analyse, constituant ainsi des cellules pyramidales putatives. De plus, les cellules devaient avoir une cadence de déclenchement d'au moins 0,2 Hz dans les 15 premières et les 15 dernières minutes de l'enregistrement pour garantir l'inclusion des seules cellules enregistrées de manière stable. Pour chaque cellule, la carte des taux a été divisée en quatre quadrants de taille égale. Le SI a été calculé séparément pour chaque quadrant et le SI moyen entre les quadrants lumineux et non lumineux a été comparé. Nous avons utilisé la définition suivante :

où λx est le taux de tir moyen dans la case spatiale x, λ le taux de tir moyen sur l'ensemble de l'environnement et P l'occupation79.

Pour évaluer la contribution des neurones EC-6b à la mémoire spatiale, nous avons croisé des souris Ctgf-2A-dgCre et RosaStopDTA pour permettre l'ablation conditionnelle de la couche de sous-plaque. On pense que les souris RosaStopDTA induisent une ablation cellulaire hautement spécifique, car les souris n'ont pas de récepteur fonctionnel pour la toxine diphtérique et le DTA n'a pas la sous-unité B nécessaire à la pénétration des membranes cellulaires80. Des descendants mâles et femelles doubles transgéniques âgés de 2 à 5 mois ont été implantés par voie sous-cutanée avec un transpondeur d'identification et 1 semaine plus tard placés dans un environnement intellicage (TSE-Systems, Allemagne) - jusqu'à 8 souris simultanément du même sexe, avec une température constante , un cycle lumineux de 12 h et un accès à volonté à la nourriture. À l'entrée de l'intellicage, les animaux ont subi une période d'accoutumance de 5 jours, au cours de laquelle tous les points d'eau étaient disponibles et ont progressivement appris à accéder à la bouteille d'eau après un délai de 10 s à partir du moment du nez dans le port. Ensuite, chaque animal a été assigné au hasard à un point d'eau individuel, parmi les huit disponibles dans chaque cage, pendant une période de 5 jours. A l'issue de cette période d'entraînement initiale, les animaux ont été répartis au hasard en un groupe expérimental, auquel ont été administrés par voie ip 150 mg g-1 de TMP, et un groupe témoin injecté avec un véhicule. Le taux d'erreur individuel a été mesuré comme le rapport entre les nez au port assigné et le nombre total de nez pendant une période de 24 h. Les souris qui n'ont pas atteint un taux d'erreur inférieur à 70 % au dernier jour de la période d'apprentissage initiale ont été exclues de l'étude et de toutes les analyses ultérieures. Immédiatement après cette manipulation, les souris ont été replacées dans leur intellicage et affectées à un port d'eau différent, pendant une période de 3 jours. Après trois rotations de ce type, toutes consistant en des changements identiques de coin et de côté, les animaux ont été à nouveau affectés à leur port d'eau d'origine, qui leur avait été attribué avant la manipulation, pour une période supplémentaire de 5 jours. À la fin de cet essai, les animaux ont été retirés de la cage, perfusés par voie transcardiaque avec du PFA à 4 % dans du PB, et les cerveaux du groupe expérimental ont été sectionnés à 100 µm pour une analyse plus approfondie de la densité synaptique CPLX3. En dehors de l'administration de TMP ou de véhicule, aucun contact direct ou indirect n'a été fait avec les animaux.

Toutes les valeurs ont été rapportées en moyenne et les barres d'erreur en ± SEM. La signification statistique a été testée à l'aide d'un test non paramétrique unilatéral de Kruskal-Wallis suivi d'un test bilatéral de Mann-Whitney pour les comparaisons post hoc, ou par le test exact de Fisher pour l'analyse des différences dans les proportions de groupe. Les comparaisons multiples ont été ajustées à l'aide de la correction de Holm-Bonferroni. Les images confocales utilisées comme représentation ont été répliquées avec succès sur différents animaux, avec des résultats identiques. Pour l'analyse des données d'intellicage, nous avons utilisé un test ANOVA unilatéral à transformation de rang aligné non paramétrique pour comparer les sessions A, D et A * 81 et un test de Friedman unilatéral non paramétrique pour examiner le cours du temps d'apprentissage. . Les calculs ont été effectués dans Microsoft Excel, Python ou R (version 4.1.0). Les différences statistiques avec p < 0,05 ont été considérées comme significatives. Dans les figures, un astérisque simple (∗), des astérisques doubles (**) et des astérisques triples (***) indiquent p < 0,05, p < 0,01 et p < 0,001, respectivement, et sont utilisés tout au long du manuscrit.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Des fichiers de données d'image supplémentaires sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code personnalisé suivant a été généré pour cette étude et est disponible via les liens suivants : Coloco3surf—https://github.com/sommerc/coloco3surf. Ktan—https://git.ist.ac.at/alois.schloegl/ktan.git. Les routines d'analyse sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions F. Marr et A. Schlögl pour l'assistance technique, E. Kralli-Beller pour l'édition du manuscrit, ainsi que C. Sommer et l'Imaging and Optics Facility de l'Institute of Science and Technology Austria (ISTA) pour les scripts d'analyse d'images et aide à la microscopie. Nous exprimons notre gratitude à J. Wallenschus et D. Rangel Guerrero pour l'assistance technique à l'acquisition de données unitaires et à I. Gridchyn pour l'aide au regroupement d'unités uniques. Enfin, nous remercions également B. Suter pour les discussions, A. Saunders, M. Jösch et H. Monyer pour la lecture critique des versions antérieures du manuscrit, C. Petersen pour le partage des protocoles de compensation et les unités de service scientifique de l'ISTA pour un soutien efficace. . Ce projet a été financé par le Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne (subvention avancée ERC n° 692692 à PJ) et le Fond zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (Z 312-B27, prix Wittgenstein pour PJ et I3600-B27 pour JGD et PV).

Yoav Ben Simon

Adresse actuelle : Département de neurophysiologie et de pharmacologie, Université de médecine de Vienne, Vienne, Autriche

Carole Kaefer

Adresse actuelle : Département de neuroinformatique, Université Radboud, Nimègue, Pays-Bas

Institut autrichien des sciences et technologies (ISTA), Klosterneuburg, Autriche

Yoav Ben-Simon, Karola Kaefer, Philipp Velicky, Jozsef Csicsvari, Johann G. Danzl et Peter Jonas

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YB a conçu le projet, conçu et réalisé toutes les expériences, YB et PV ont acquis des images STED conseillées par JGD, KK et YB ont analysé des données unitaires, JC a fourni des installations et de l'équipement pour les enregistrements de tétrode, YB a analysé les données, YB et PJ ont écrit le manuscrit, et PJ a supervisé le projet. Tous les auteurs ont lu et commenté le manuscrit.

Correspondance à Yoav Ben-Simon.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Ben-Simon, Y., Kaefer, K., Velicky, P. et al. Une projection excitatrice directe des neurones de la couche entorhinale 6b vers l'hippocampe contribue au codage spatial et à la mémoire. Nat Commun 13, 4826 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32559-8

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Reçu : 11 avril 2022

Accepté : 03 août 2022

Publié: 16 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32559-8

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