Un module d'interaction ancestral favorise l'oligomérisation dans des ATP synthases mitochondriales divergentes

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 5989 (2022) Citer cet article

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L'ATP synthase mitochondriale forme des dimères stables disposés en assemblages oligomères qui génèrent la courbure de la membrane interne essentielle à une conversion d'énergie efficace. Ici, nous rapportons les structures cryo-EM du dimère d'ATP synthase intact de Trypanosoma brucei dans dix états de rotation différents. Le modèle se compose de 25 sous-unités, dont neuf spécifiques à la lignée, ainsi que de 36 lipides. Le mécanisme rotatif est influencé par la tige périphérique divergente, conférant une plus grande flexibilité conformationnelle. Le transfert de protons dans le demi-canal luminal se produit via une chaîne de cinq molécules d'eau ordonnées. L'interface de dimérisation est formée par la sous-unité-g qui est critique pour les interactions mais pas pour l'activité catalytique. Bien que l'architecture globale des dimères varie parmi les eucaryotes, nous constatons que la sous-unité-g et la sous-unité-e forment un motif d'oligomérisation ancestral, qui est partagé entre les lignées trypanosomiennes et mammifères. Par conséquent, nos données définissent le module sous-unité-g/e comme un composant structurel déterminant les assemblages oligomères d'ATP synthase.

L'ATP synthase mitochondriale est constituée des sous-complexes solubles F1 et Fo liés à la membrane et se présente sous forme de dimères qui s'assemblent en oligomères pour induire la formation de plis de la membrane interne, appelés crêtes. Les crêtes sont les sites de phosphorylation oxydative et de conversion d'énergie dans les cellules eucaryotes. La dissociation des dimères d'ATP synthase en monomères entraîne la perte de l'architecture des crêtes natives et altère la fonction mitochondriale1,2. Alors que la morphologie des crêtes varie considérablement entre les organismes de différentes lignées, allant de lamellaire plat chez les opisthokonts à tubulaire enroulé chez les ciliés et discoïde chez les euglénozoaires3, les dimères mitochondriaux d'ATP synthase représentent une occurrence universelle pour maintenir la forme de la membrane4.

Les dimères d'ATP synthase de taille et d'architecture variables, classés en types I à IV, ont récemment été résolus par des études cryo-EM à haute résolution. Dans la structure du dimère d'ATP synthase de type I des mammifères, les monomères ne sont que faiblement associés5,6, et dans la levure, les insertions dans les sous-unités membranaires forment des contacts plus étroits7. La structure du dimère d'ATP synthase de type II de l'algue Polytomella sp. ont montré que l'interface dimère est formée par des composants spécifiques au phylum8. Le dimère d'ATP synthase de type III du cilié Tetrahymena thermophila est caractérisé par des axes rotatifs parallèles, et une sous-unité sous-stoechiométrique, ainsi que plusieurs lipides ont été identifiés à l'interface dimère, tandis que des composants protéiques supplémentaires qui lient les monomères ensemble sont répartis entre la matrice , régions transmembranaire et luménale9. La structure de l'ATP synthase de type IV avec les lipides natifs d'Euglena gracilis a également montré que des interactions protéine-lipide spécifiques contribuent à la dimérisation et que les tiges centrales et périphériques interagissent directement les unes avec les autres10. Enfin, une ATP synthase apicomplexe unique se dimérise via 11 composants spécifiques au parasite qui contribuent à environ 7000 Å2 de surface enfouie11, et contrairement à toutes les autres ATP synthases, qui s'assemblent en rangées, elle s'associe dans des états oligomères supérieurs de pyramides pentagonales dans les régions membranaires apicales courbes . Ensemble, les données structurelles disponibles suggèrent une diversité d'oligomérisation, et on ne sait toujours pas si des éléments communs médiant ces interactions existent ou si la dimérisation de l'ATP synthase s'est produite indépendamment et plusieurs fois au cours de l'évolution4.

L'ATP synthase de Trypanosoma brucei, un représentant des kinétoplastides et un organisme modèle établi médicalement important causant la maladie du sommeil, est très divergente, illustrée par la tête F1 en forme de pyramide contenant une sous-unité spécifique du phylum12,13. Les dimères sont sensibles au manque de cardiolipine14 et forment de courts segments hélicoïdaux gauches qui s'étendent à travers la crête membranaire des crêtes discoïdes15. Uniquement parmi les eucaryotes aérobies, le stade du cycle de vie des mammifères de T. brucei utilise le mode inverse de l'ATP synthase, utilisant l'enzyme comme pompe à protons pour maintenir le potentiel de la membrane mitochondriale aux dépens de l'ATP16,17. En revanche, les stades d'insectes du parasite utilisent le mode direct de production d'ATP de l'enzyme18,19.

Compte tenu de la conservation des sous-unités centrales, de la nature différente de l'oligomérisation et de la capacité de tester biochimiquement les hypothèses structurelles, nous avons estimé que l'étude de la structure et de la fonction de l'ATP synthase de T. brucei fournirait le lien évolutif manquant pour comprendre comment les monomères interagissent pour former dimères physiologiques.

Ici, nous abordons cette question en combinant une analyse structurelle, fonctionnelle et évolutive du dimère d'ATP synthase de T. brucei.

Nous avons purifié les dimères d'ATP synthase à partir de trypomastigotes procycliques de T. brucei en culture par chromatographie d'affinité avec un inhibiteur de protéine naturelle recombinante TbIF120 et avons soumis l'échantillon à une analyse cryo-EM (Figs. 1 et 2 supplémentaires). En utilisant des raffinements masqués, des cartes ont été obtenues pour la région de la membrane, le rotor et la tige périphérique. Pour décrire l'espace conformationnel de l'ATP synthase de T. brucei, nous avons résolu dix sous-états rotatifs distincts, qui ont été affinés à une résolution de 3,5 à 4,3 Å. Enfin, des particules avec les deux monomères à l'état de rotation 1 ont été sélectionnées et la structure consensus du dimère a été affinée à une résolution de 3, 2 Å (tableau supplémentaire 1, figures supplémentaires 2 et 3).

Contrairement à l'architecture à grand angle des dimères trouvés chez les animaux et les champignons, l'ATP synthase de T. brucei affiche un angle de 60° entre les deux sous-complexes F1/c-ring. Le modèle de l'ATP synthase de T. brucei comprend les 25 sous-unités différentes, dont neuf sont spécifiques à la lignée (Fig. 1a, Fig. 4 supplémentaire et Film supplémentaire 1). Nous avons nommé les sous-unités selon la nomenclature proposée précédemment21,22,23 (tableau supplémentaire 2). De plus, nous avons identifié et modélisé 36 phospholipides liés, dont 24 cardiolipines (Fig. 5 supplémentaire). Les deux détergents utilisés lors de la purification, le n-dodécyl β-D-maltoside (β-DDM) et la glyco-diosgénine (GDN) sont également résolus à la périphérie de la région membranaire (Fig. 6 supplémentaire).

a Vues de face et de côté du modèle composite avec les deux monomères dans l'état de rotation 1. Les deux complexes d'anneaux F1/c10, chacun augmenté de trois copies de la sous-unité p18 spécifique au phylum, sont liés ensemble à un angle de 60°. La région Fo liée à la membrane affiche une architecture unique et est composée à la fois de sous-unités conservées et spécifiques au phylum. b Vue latérale de la région Fo montrant l'interaction luminale du barillet β à dix brins du c-ring (gris) avec ATPTB12 (bleu pâle). La cavité Fo périphérique remplie de lipides est indiquée. c Vue rapprochée des lipides liés dans la cavité Fo périphérique avec la densité cryo-EM illustrée. d Vue de dessus dans le cycle c décamérique avec un ribonucléoside triphosphate de pyrimidine lié, attribué comme UTP, bien que non détecté expérimentalement. Densité de la carte indiquée en bleu transparent, résidus en interaction affichés.

Dans la région catalytique, F1 est augmenté de trois copies de la sous-unité p18, chacune liée à la sous-unité-α12,13. Notre structure montre que p18 est impliqué dans l'attachement inhabituel de F1 à la tige périphérique. La région membranaire comprend huit sous-unités Fo conservées (b, d, f, 8, i/j, k, e et g) disposées autour de la sous-unité centrale du translocateur de protons-a. Nous avons identifié ces sous-unités en fonction de la similitude structurelle et de la topologie correspondante avec leurs homologues de levure (Fig. 2). Pour la sous-unité-b, une seule hélice transmembranaire se superpose bien avec bH1 de la levure et ancre les sous-unités-e et -g au Fo (Fig. 2a, b). Dans les synthases d'ATP de levure et de bovin, bH1 et les hélices transmembranaires des sous-unités -e et -g sont disposées de la même manière que dans notre structure et contribuent à un coin caractéristique dans le domaine membranaire5. La longue hélice bH2, qui constitue la partie centrale de la tige périphérique chez d'autres organismes, est absente chez T. brucei (Fig. 2c). Aucune sous-unité alternative-b24 n'est trouvée dans notre structure.

a Vue de dessus de la région membranaire avec les sous-unités de T. brucei (colorées) recouvertes de la structure de S. cerevisiae (gris transparent). Une superposition structurelle étroite et une topologie correspondante ont permis l'attribution de sous-unités conservées en fonction de la topologie et de l'emplacement correspondants. b La superposition des sous-unités -b, -e et -g avec leurs homologues S. cerevisiae PDB 6B2Z (S. cerevisiae mitochondrial ATP synthase) confirme leur identité. c Représentation schématique des hélices transmembranaires de la sous-unité b et des sous-unités adjacentes chez T. brucei, E. gracilis PDB 6TDV (E. gracilis mitochondrial ATP synthase, région membranaire)10 et S. cerevisiae PDB 6B2Z (S. cerevisiae mitochondrial ATP synthase)7 ATP synthases. PC – phosphatidylcholine.

La région membranaire contient un sous-complexe périphérique, formé principalement par les ATPTB1, 6, 12 et ATPEG3 spécifiques au phylum (Fig. 1b). Il est séparé du noyau conservé par une cavité intrinsèque à la membrane, dans laquelle neuf cardiolipines liées sont résolues (Fig. 1c), et l'extrémité C-terminale d'ATPTB12 interagit avec le barillet β luminal de l'anneau c10. Le barillet β, qui a déjà été signalé également dans l'ATP synthase de E. gracilis10, s'étend de l'anneau c10 d'environ 15 Å à la lumière (Fig. 1a et Fig. 7 supplémentaire). La cavité du c-anneau décamérique contient une densité compatible avec des lipides désordonnés, comme observé dans d'autres ATP synthases5,6,7, et en plus près du côté de la matrice, 10 résidus Arg66c coordonnent une densité de ligand, ce qui est compatible avec un ribonucléoside triphosphate de pyrimidine (Fig. 1d). Nous attribuons cette densité comme uridine-triphosphate (UTP), en raison de sa grande exigence dans le métabolisme de l'ARN mitochondrial des trypanosomes africains étant un substrat pour l'édition post-transcriptionnelle de l'ARN25, et l'ajout de queues de poly-uridine aux ARNg et ARNr26,27, comme ainsi qu'en raison de la faible abondance de cytidine triphosphate (CTP)28. La base nucléotidique est insérée entre deux résidus Arg82c, tandis que la région triphosphate est coordonnée par cinq autres résidus Arg82c, Tyr79δ et Asn76δ fournissant des contacts de coordination asymétriques. La présence d'un nucléotide à l'intérieur du c-ring est surprenante, étant donné les rapports récents de phospholipides à l'intérieur des c-rings chez les mammifères5,6 et les ciliés9, indiquant qu'une gamme de ligands différents peut fournir un échafaudage structurel.

La tige périphérique trypanosomienne présente une architecture nettement différente par rapport à ses homologues de levure et de mammifère. Dans les complexes d'opisthokont, la tige périphérique est organisée autour du long bH2, qui s'étend de la membrane ~ 15 nm dans la matrice et se fixe à OSCP au sommet de F15,7. En revanche, T. brucei n'a pas le bH2 canonique et à la place, les hélices 5-7 de la sous-unité-d divergente et l'hélice C-terminale de la sous-unité étendue-8 se lient à une extension C-terminale de l'OSCP à la partie apicale de la tige périphérique (Fig. 3a). L'interaction entre l'OSCP et les sous-unités-d et -8 est stabilisée par l'ATPTB3 et l'ATPTB4 solubles. La tige périphérique est ancrée au sous-complexe membranaire par une hélice transmembranaire de la sous-unité-8, enveloppée du côté de la matrice par les hélices 8-11 de la sous-unité-d. Outre les contacts canoniques au sommet de la F1, la tige périphérique est attachée à la F1 via une extension C-terminale spécifique aux euglénozoaires de l'OSCP, qui contient un lieur désordonné et une épingle à cheveux en hélice terminale s'étendant entre la p18 liée à la F1 et les sous-unités. -d et -8 de la tige périphérique (Fig. 3a et Films supplémentaires 2, 3). Une autre interaction de F1 avec la tige périphérique se produit entre les hélices C-terminales empilées des sous-unités-β et -d (Fig. 3b), cette dernière appartenant structurellement à F1 et étant connectée à la tige périphérique via un lieur flexible.

une extension OSCP N-terminale fournit une fixation permanente de la tige centrale, tandis que l'extension C-terminale fournit une fixation spécifique au phylum à la tige périphérique divergente. b Les hélices C-terminales des sous-unités -β et -d fournissent un attachement F1 permanent. c Sous-étapes de l'anneau en c lors de la transition de l'état de rotation 1 à 2. d Mouvement F1 prenant en compte les étapes illustrées en (c). Après avoir avancé avec le rotor jusqu'à l'état 1e, le F1 tourne dans le sens opposé lors de la transition vers l'état 2a. e Mouvement d'inclinaison de F1 et adaptation à la flexion de la tige périphérique.

Pour évaluer si l'architecture inhabituelle de la tige périphérique influence le mécanisme de rotation, nous avons analysé 10 classes représentant différents états de rotation. Les trois états principaux (1–3) résultent de trois pas de rotation d'environ 120° du rotor par rapport au Fo statique. Dans toutes les classes, F1 est dans une conformation similaire, correspondant au séjour catalytique, observé précédemment également dans la structure cristalline de T. brucei F1-ATPase13. Conformément à la rotation d'environ 120 ° de la tige centrale, les conformations et l'occupation des nucléotides des interfaces catalytiques des dimères αβ individuels diffèrent entre les états principaux, montrant l'ADP et l'ATP dans les conformations fermées "lâches" et "serrées", respectivement , et un site de liaison de nucléotide vide dans la conformation "ouverte". Nous avons identifié cinq (1a–1e), quatre (2a–2d) et une (3) classes des états principaux respectifs. Les positions de rotor des états de rotation la, 2a et 3 sont liées par des pas de 117°, 136° et 107°, respectivement. Tout au long de toutes les sous-étapes identifiées de l'état de rotation 1 (classes 1a à 1e), le rotor tourne d'environ 33°, ce qui correspond approximativement à l'avancement d'une sous-unité-c de l'anneau c10 (Fig. 3c). En tournant avec le rotor, le casque F1 est en retard, avançant de seulement ~ 13 °. Lors de la transition suivante de 1e à 2a, le rotor avance d'environ 84°, tandis que la têtière F1 tourne d'environ 22° dans le sens opposé (Fig. 3d). Cela génère un couple dans le sens inverse entre les deux moteurs, ce qui est cohérent avec un mécanisme à course motrice. Ce couple dans le sens inverse peut se produire dans les trois principales transitions d'état de rotation. Cependant, il n'a été observé que dans l'état principal 1, car il a été capturé dans plus de sous-étapes que les deux états restants, probablement en raison du décalage de symétrie entre le cycle c décamère et l'hexamère α3β3. Dans les quatre classes de l'état 2, le rotor avance de 23° et F1 revient près de sa position observée dans la classe 1a, où il se retrouve également dans la seule classe observée de l'état 3. Bien qu'avec de petites différences dans la taille des pas, cette mécanisme est cohérent avec une observation précédente dans la Polytomella ATP synthase8. Cependant, en raison de sa grande tige périphérique rigide, la Polytomella ATP synthase affiche principalement des sous-étapes de rotation, tandis que le Trypanosoma F1 affiche également un mouvement d'inclinaison d'environ 8° révélé par les états de rotation 1a et 1b (Fig. 3e et Film supplémentaire 2). Le mouvement de charnière précédemment rapporté entre les domaines N- et C-terminaux d'OSCP8 ne se trouve pas dans nos structures, à la place, les changements conformationnels du sous-complexe F1/c10-ring sont pris en charge par une flexion de 5° de la partie apicale du périphérique. tige. (Fig. 3e et films supplémentaires 2, 3). Ensemble, les données structurelles indiquent que l'attachement divergent de la tige périphérique confère une plus grande flexibilité conformationnelle à l'ATP synthase de T. brucei.

Le mécanisme de translocation de protons implique la protonation séquentielle de E102 des sous-unités-c, la rotation du cycle c10 avec E102c neutralisé exposé à la bicouche phospholipidique et la libération de protons de l'autre côté de la membrane. Les sites de liaison et de libération des protons sont séparés par le R146 conservé apporté par l'hélice horizontale H5 de la sous-unité a et sont accessibles depuis la lumière des crêtes et la matrice mitochondriale par des demi-canaux aqueux (Fig. 4a). Ensemble, R146 et le N209 adjacent coordonnent une paire de molécules d'eau entre les hélices H5 et H6 (Fig. 4b). Une coordination similaire a été observée dans l'ATP synthase de Polytomella8. La coordination de l'eau limite probablement le R146 aux rotamères qui s'étendent vers le cycle c, avec lequel on pense qu'il interagit.

une sous-unité-a (verte) avec les canaux de la matrice (orange) et de la lumière (bleu clair), et une phosphatidylcholine ordonnée (PC1 ; bleu). E102 de l'anneau c10 représenté en gris. b Vue rapprochée des R146a et N209a hautement conservés, qui coordonnent deux molécules d'eau entre les hélices H5-6a. c Vue latérale du canal luminal avec voie des protons (bleu clair) et confinement de la phosphatidylcholine (bleu). d Chaîne de molécules d'eau ordonnées dans le canal luminal. Les distances entre W1 et W5 (rouge) sont respectivement de 5,2, 3,9, 7,3 et 4,8 Å. e Les eaux ordonnées s'étendent jusqu'à H155a, qui assure probablement le transfert de protons vers D202a.

Dans notre structure, le demi-canal luminal, qui affiche une résolution locale de 2,55 Å (Fig. 3 supplémentaire), est rempli d'un réseau de densités d'eau résolues, se terminant par une chaîne de cinq molécules d'eau ordonnées (W1-W5 ; Fig. . 4c–e). La présence de molécules d'eau ordonnées dans le canal aqueux est cohérente avec un mécanisme de type Grotthuss pour le transfert de protons, qui ne nécessiterait pas la diffusion à longue distance des molécules d'eau5. Cependant, comme certaines distances entre les molécules d'eau observées sont trop grandes pour une liaison hydrogène directe, le transfert de protons peut impliquer à la fois des molécules d'eau coordonnées et désordonnées. La distance de 7 Å entre la dernière eau résolue (W1) et D202a, le résidu conservé dont on pense qu'il transfère les protons au cycle c, est trop longue pour le transfert direct de protons. Au lieu de cela, il peut se produire via le H155a adjacent. Par conséquent, notre structure résout les éléments individuels participant au transport de protons (Fig. 4d, e).

Le demi-canal luminal de protons dans l'ATP synthase de mammifère5,6 et d'apicomplexane11 est tapissé par la partie transmembranaire de bH2, qui est absente chez T. brucei. Au lieu de cela, la position de bH2 est occupée par une phosphatidylcholine entièrement ordonnée dans notre structure (PC1; Fig. 4a, c). Par conséquent, un lipide lié remplace un élément protéique dans le trajet du proton.

Malgré le partage d'un ensemble de sous-unités Fo conservées, le dimère d'ATP synthase de T. brucei affiche une architecture de dimère nettement différente par rapport aux structures précédemment déterminées. Premièrement, son interface de dimérisation de 3600 Å2 est plus petite que celle des synthases d'ATP de type IV d'E. gracilis (10 000 Å2) et de T. thermophila de type III (16 000 Å2). Deuxièmement, contrairement à l'ATP synthase mammifère et fongique, dans laquelle les tiges périphériques s'étendent dans le plan défini par les deux axes rotatifs, dans notre structure, les monomères sont tournés de telle sorte que les tiges périphériques sont décalées latéralement sur les côtés opposés du plan. En raison des monomères en rotation, cette architecture est associée à une interface de dimérisation spécifique, où deux copies de la sous-unité g interagissent de manière homotypique sur l'axe de symétrie C2 (Fig. 5a et Film supplémentaire 1). Les deux copies de H1-2g s'étendent horizontalement le long du côté matrice de la membrane, se serrant l'une contre l'autre (Fig. 5c, e). Cela facilite la formation de contacts entre une hélice transmembranaire associée de la sous-unité-e avec le monomère voisin via la sous-unité-a 'dans la membrane et -f'dans la lumière, contribuant ainsi davantage à l'interface (Fig. 5b). Ainsi, le dimère d'ATP synthase est assemblé via le module de sous-unité-e/g. La partie C-terminale de l'hélice de la sous-unité e s'étend dans la lumière, vers le barillet β à dix brins de l'anneau c (Fig. 7a supplémentaire). Les résidus terminaux 23 sont désordonnés avec une densité mal résolue se connectant au bouchon de détergent du barillet β du c-ring (Fig. 7b supplémentaire). Cela ressemble à l'extrémité C-terminale luminale de la sous-unité-e dans la structure bovine5, indiquant une interaction conservée avec l'anneau c. Chez les mammifères, un mécanisme dans lequel la rétraction de la sous-unité-e lors de l'exposition au calcium retire le bouchon lipidique et induit le désassemblage de l'anneau c, ce qui déclenche l'ouverture des pores de transition de perméabilité (PTP), a été proposé6.

a Vue latérale avec des sous-unités de dimérisation colorées. L'interface dimère est constituée par la sous-unité b-e' mettant en contact la sous-unité-a dans la membrane et la sous-unité-f dans la lumière, les sous-unités c e et g des deux monomères formant un sous-complexe avec les lipides liés. d Les sous-unités-g et -e forment un motif de dimérisation dans le dimère d'ATP synthase trypanosomienne (type IV) (cette étude), le même élément structurel forme le motif d'oligomérisation dans le tétramère d'ATP synthase porcine. La similarité structurelle du pseudo-dimère (c.-à-d. deux monomères diagonaux provenant de dimères adjacents) dans la structure porcine avec le dimère trypanosomien suggère que les dimères d'ATP synthase de type I et IV ont évolué par divergence à partir d'un ancêtre commun. e Les structures dimériques de la sous-unité e/g sont conservées dans Sus scrofa PDB 6ZNA (S. scrofa mitochondrial ATP synthase) et T. brucei (ce travail) et contiennent un motif GXXXG conservé (orange) médiant l'interaction des hélices transmembranaires. f Modèles des dimères d'ATP synthase intégrés aux moyennes de sous-tomogrammes d'oligomères courts15 : vue matricielle, à gauche ; coupe à travers, milieu, vue luménale, droite ; EMD-3560 (structure in situ de l'ATP synthase mitochondriale de T. brucei).

Le module e / g est maintenu ensemble par quatre cardiolipines liées dans le feuillet matriciel, l'ancrant à la région Fo restante (Fig. 5c). Les groupes de tête des lipides sont coordonnés par des résidus polaires et chargés, leurs chaînes acyle remplissant une cavité centrale dans la région membranaire à l'interface dimère (Fig. 5c et Fig. 5f supplémentaire). La liaison à la cardiolipine a déjà été signalée comme étant obligatoire pour la dimérisation dans les transporteurs secondaires30 et l'épuisement de la cardiolipine synthase a entraîné des niveaux réduits d'ATP synthase dans les trypanosomes sanguins14.

Fait intéressant, pour les levures, les premières études d'électrophorèse sur gel natif bleu31 et de calcul de la moyenne des sous-tomogrammes2 ont suggéré que la sous-unité-g était potentiellement médiatrice des dimères, mais les modules e/g sont situés latéralement opposés de chaque côté de l'axe long du dimère, à la périphérie du complexe, ~ 8,5 nm l'un de l'autre. Étant donné que les modules e/g n'interagissent pas directement dans le dimère d'ATP synthase de levure, il a été proposé qu'ils servent d'éléments de flexion de la membrane, alors que les principaux contacts dimères sont formés par les sous-unités-a et -i/j7. Chez les mammifères, le module e/g occupe la même position que chez les levures, formant l'interaction entre deux monomères diagonaux dans un tétramère5,6,32, ainsi qu'entre dimères parallèles33. La comparaison avec notre structure montre que l'organisation globale du module e/g intra-dimérique des trypanosomes et des mammifères inter-dimériques est structurellement similaire (Fig. 5d). De plus, les parasites kinétoplastidés et les mammifères partagent des motifs GXXXG conservés dans les sous-unités-e34 et -g (Fig. 8 supplémentaire), qui permettent une interaction étroite de leurs hélices transmembranaires (Fig. 5e), fournissant une preuve supplémentaire de l'homologie des sous-unités. Cependant, alors que les dimères d'ATP synthase de mammifères sont disposés perpendiculairement au grand axe de leurs rangées le long du bord des crêtes35, les dimères de T. brucei sur les bords des crêtes discoïdes sont inclinés d'environ 45° par rapport à l'axe des rangées15. Par conséquent, le module e/g occupe des positions équivalentes dans les rangées des deux groupes évolutifs distants (Fig. 5f et réf. 33).

Pour valider les informations structurelles, nous avons renversé chaque sous-unité Fo individuelle par interférence ARN inductible (ARNi). Tous les ARNm cibles ont chuté à 5 à 20% de leurs niveaux d'origine après deux et quatre jours d'induction (Fig. 6a et Fig. 9a supplémentaire). L'analyse par Western blot de lysats de cellules entières résolus par électrophorèse dénaturante a révélé une diminution des niveaux de sous-unités Fo ATPB1 et -d suggérant que l'intégrité de la fraction Fo dépend de la présence d'autres sous-unités Fo (Fig. 6c, d). L'immunotransfert de complexes mitochondriaux résolus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif bleu (BN-PAGE) avec des anticorps dirigés contre les sous-unités F1 et Fo a révélé une forte diminution ou une perte presque complète des formes dimères et monomères d'ATP synthases quatre jours après l'induction de l'ARNi de la plupart des sous-unités (b , e, f, i/j, k, 8, ATPTB3, ATPTB4, ATPTB6, ATPTB11, ATPTB12, ATPEG3 et ATPEG4), documentant une instabilité accrue de l'enzyme ou des défauts dans son assemblage. L'accumulation simultanée de F1-ATPase, observée par BN-PAGE, a démontré que la fraction catalytique reste intacte après la rupture de la tige périphérique ou du sous-complexe membranaire (Fig. 6b – d et Fig. 9b supplémentaire).

a Courbes de croissance de lignées cellulaires d'ARNi non induites (lignes pleines) et induites par la tétracycline (lignes pointillées) cultivées en présence (noir) ou en l'absence (marron) de glucose. Les encarts montrent les niveaux relatifs de l'ARNm cible respectif aux jours indiqués après l'induction (DPI) normalisés aux niveaux d'ARNr 18S (barres noires) ou de β-tubuline (barres blanches). b Immunoblots de lysats mitochondriaux provenant de lignées cellulaires ARNi indiquées résolues par BN-PAGE sondées avec des anticorps contre les sous-unités d'ATP synthase indiquées (n = 2). Les positions du marqueur de poids moléculaire (MW) sont indiquées. c Immunoblots de lysats de cellules entières provenant de lignées cellulaires ARNi indiquées sondées avec les anticorps indiqués (n = 3). Les positions du marqueur MW sont indiquées. d Quantification de trois répliques indépendantes d'immunoblots en (c). Les valeurs ont été normalisées au signal du contrôle de chargement Hsp70 et aux cellules non induites. Les tracés montrent les valeurs individuelles, les moyennes et les écarts-types (SD ; barres d'erreur).

Contrairement aux autres sous-unités Fo ciblées, la régulation à la baisse de la sous-unité-g avec l'ARNi a entraîné une perte spécifique de complexes dimères avec accumulation concomitante de monomères (Fig. 6b), indiquant qu'elle est nécessaire pour la dimérisation, mais pas pour l'assemblage et stabilité des unités monomères F1Fo ATP synthase. La microscopie électronique à transmission de sections de cellules minces a révélé que la monomérisation de l'ATP synthase dans la lignée cellulaire sous-unité-gARNi avait le même effet sur l'ultrastructure mitochondriale que la perte presque complète de monomères et de dimères lors de l'inactivation de la sous-unité-8. Les deux lignées cellulaires présentaient une diminution du nombre de crêtes et une morphologie aberrante des crêtes (Fig. 7a, b), y compris l'apparition de formes rondes rappelant les structures détectées lors de la suppression de la sous-unité -g ou -e chez Saccharomyces cerevisiae1. Ces résultats indiquent que la monomérisation empêche l'ATP synthase trypanosomienne de s'assembler en courtes rangées hélicoïdales sur les bords des crêtes discoïdes15, comme cela a été rapporté pour une oligomérisation altérée chez les homologues d'autres eucaryotes2,36.

a Micrographies électroniques à transmission de sections de lignées cellulaires ARNi non induites ou induites sur 4 jours. Au moins 70 micrographies ont été obtenues dans chaque catégorie. Les membranes mitochondriales et les crêtes sont marquées respectivement de pointes de flèches bleues et rouges. Le panneau supérieur montre des exemples de sections transversales irrégulières, allongées et rondes de mitochondries quantifiées en (b). Barres d'échelle : 500 nm. b Nombre de crêtes par vésicule provenant de lignées cellulaires induites (IND) ou non induites (NON) indiquées comptées séparément dans une section mitochondriale irrégulière, allongée et ronde. Les boîtes et les moustaches indiquent respectivement les 25e à 75e et 5e à 95e centiles. Les nombres de sections analysées sont indiqués pour chaque point de données. Test t bilatéral non apparié, les valeurs p sont affichées dans le graphique. c Capacité de polarisation de la membrane mitochondriale des lignées cellulaires non induites ou induites par l'ARNi deux et quatre DPI mesurées par la safranine O. Les flèches noires et grises indiquent l'ajout d'ATP et d'oligomycine, respectivement. d Production d'ATP dans des cellules perméabilisées non induites (0) ou induites par ARNi 2 et 4 DPI en présence des substrats et inhibiteurs indiqués. Les graphiques montrent les valeurs individuelles de deux répétitions techniques de n = 2 (sous-unité-8), n = 3 (ATPTB4) ou n = 4 (sous-unité-g) expériences indépendantes et moyennes (barres) et SD (barres d'erreur) de la valeurs moyennes des répétitions techniques. phosphate de DL-glycérol Gly3P; cyanure de potassium KCN; CATR carboxyatractyloside.

Malgré l'ultrastructure mitochondriale altérée, les cellules de la sous-unité-gARNi n'ont montré qu'un phénotype de croissance très doux, contrairement à toutes les autres lignées cellulaires d'ARNi qui ont présenté une croissance régulièrement ralentie du troisième au quatrième jour après l'induction de l'ARNi (Fig. 7a et Supplémentaire Fig. 9a ). Ceci est cohérent avec les défauts de croissance observés après l'ablation de la sous-unité Fo ATPTB119 et des sous-unités F1-α et p1812. Ainsi, la monomérisation de l'ATP synthase lors de l'ablation de la sous-unité g n'avait qu'un effet négligeable sur l'aptitude des trypanosomes cultivés dans un milieu riche en glucose, dans lequel la production d'ATP par la phosphorylation au niveau du substrat compense partiellement la phosphorylation oxydative compromise37.

La mesure de la polarisation de la membrane mitochondriale dépendante de l'ATP sensible à l'oligomycine par dosage de la safranine O dans des cellules perméabilisées a montré que l'activité de pompage de protons de l'ATP synthase dans les cellules induites de la sous-unité-gARNi est affectée de manière négligeable, démontrant que l'enzyme monomérisée est catalytiquement fonctionnelle. En revanche, la régulation négative de l'ARNi de la sous-unité 8, de l'ATPTB4 et de l'ATPTB11 et de l'ATPTB1 a entraîné une forte baisse de la capacité de polarisation de la membrane mitochondriale, compatible avec la perte des formes d'ATP synthase monomérique et dimérique (Fig. 7c). En conséquence, l'inactivation des mêmes sous-unités a entraîné une incapacité à produire de l'ATP par phosphorylation oxydative (Fig. 7d). Cependant, lors de l'ablation de la sous-unité g, la production d'ATP n'a été affectée que partiellement, confirmant que l'ATP synthase monomérisée reste catalytiquement active. La baisse d'environ 50 % de la production d'ATP des cellules de la sous-unité-gARNi peut être attribuée à la diminution de l'efficacité de la phosphorylation oxydative en raison de la morphologie des crêtes altérée. En effet, lorsque les cellules étaient cultivées en l'absence de glucose, imposant le besoin de phosphorylation oxydative, l'inactivation de la sous-unité-g entraîne un arrêt de la croissance, bien qu'un à deux jours plus tard que l'inactivation de toutes les autres sous-unités testées (Fig. 6a). Les données montrent que la dimérisation est critique lorsque la phosphorylation oxydative est la source prédominante d'ATP.

Notre structure du dimère d'ATP synthase mitochondriale du parasite mammifère T. brucei offre un nouvel aperçu du mécanisme de mise en forme de la membrane, de la catalyse rotative et du transfert de protons. Considérant que les trypanosomes appartiennent à un groupe évolutif divergent de Kinetoplastida, le dimère d'ATP synthase a plusieurs caractéristiques intéressantes qui diffèrent des autres structures dimères. La sous-unité b trouvée dans les ATP synthases bactériennes et autres mitochondriales de type F semble être fortement réduite à une seule hélice transmembranaire bH1. Le long bH2, qui constitue la partie centrale de la tige périphérique chez d'autres organismes, et est également impliqué dans la composition du demi-canal protonique luminal, est complètement absent chez T. brucei. Fait intéressant, la position de bH2 dans le demi-canal du proton est occupée par une molécule de phosphatidylcholine entièrement ordonnée qui remplace un élément protéique bien conservé dans le trajet du proton. Cependant, ce remplacement n'est pas un trait commun à toutes les synthases d'ATP de type IV, car la sous-unité b d' E. gracilis contient le bH2 canonique mais manque de bH110. Ainsi, alors que la sous-unité b est conservée chez Euglenozoa, les lignées de T. brucei et E. gracilis ont conservé leurs différents éléments structurels non chevauchants (Fig. 2c). Le manque de bH2 chez T. brucei affecte également la composition de la tige périphérique dans laquelle la sous-unité divergente d et la sous-unité 8 se lient directement à une extension C-terminale de l'OSCP, indiquant une architecture de tige périphérique remodelée. La tige périphérique entre en contact avec la coiffe F1 à plusieurs endroits, conférant une plus grande flexibilité conformationnelle à l'ATP synthase.

En utilisant les données structurelles et fonctionnelles, nous avons également identifié un élément structurel conservé de l'ATP synthase qui est responsable de sa multimérisation. En particulier, la sous-unité-g est nécessaire pour la dimérisation, mais dispensable pour l'assemblage des monomères F1Fo. Bien que l'enzyme monomérisée soit catalytiquement compétente, l'incapacité à former des dimères entraîne une structure de crête défectueuse et, par conséquent, conduit à une phosphorylation oxydative compromise et à l'arrêt de la prolifération. Les propriétés de formation de crêtes des dimères d'ATP synthase mitochondriale sont essentielles pour une production suffisante d'ATP par phosphorylation oxydative, mais pas pour d'autres fonctions mitochondriales, comme en témoigne l'absence de phénotype de croissance des cellules sous-unités-gARNi en présence de glucose. Ainsi, la souche d'appauvrissement de la sous-unité g trypanosomienne représente un outil expérimental pour évaluer les rôles de la fonction catalytique primaire de l'enzyme et de l'activité de mise en forme de la membrane spécifique aux mitochondries, soulignant l'importance de cette dernière pour la phosphorylation oxydative.

Sur la base de nos données et des structures précédemment publiées, nous proposons un état ancestral avec des doubles rangées de monomères ATP synthase reliés par des modules e/g longitudinalement et par d'autres sous-unités Fo transversalement. Au cours de l'évolution, différentes paires d'unités monomères d'ATP synthase adjacentes ont formé des dimères stables dans des lignées individuelles (Fig. 8). Cela a donné naissance aux dimères très divergents d'ATP synthase de type I et de type IV avec des modules de sous-unité e / g servant respectivement de motifs d'oligomérisation ou de dimérisation. Étant donné que les trypanosomes appartiennent au supergroupe eucaryote à ramification profonde Discoba, l'arrangement proposé pourrait avoir été présent chez le dernier ancêtre commun eucaryote. Bien que la similarité de séquence de la sous-unité-g soit faible et limitée à la seule hélice transmembranaire, nous avons trouvé des homologues de la sous-unité-g en plus d'Opisthokonta et Discoba également chez Archaeplastida et Amoebozoa, qui représentent d'autres supergroupes eucaryotes, soutenant ainsi le rôle ancestral dans l'oligomérisation ( Fig. 8 supplémentaire). Pris ensemble, notre analyse révèle que les synthases d'ATP mitochondriales qui affichent une architecture nettement divergente partagent le module structurel ancestral qui favorise l'oligomérisation.

Modèle schématique de l'évolution des synthases d'ATP de type I et IV. Les ATP synthases mitochondriales sont dérivées d'un complexe monomérique d'origine protéobactérienne. Chez un ancêtre mitochondrial, l'acquisition de sous-unités spécifiques aux mitochondries, y compris le module de sous-unité-e/g, a entraîné l'assemblage de doubles rangées d'ATP synthase, la base structurelle de la biogenèse des crêtes. Par divergence, différentes architectures d'ATP synthase ont évolué, le module de la sous-unité e/g fonctionnant comme un motif d'oligomérisation (type I) ou de dimérisation (type IV), entraînant des assemblages de rangées distincts entre les lignées mitochondriales.

Des souches procycliques de T. brucei ont été cultivées dans du milieu SDM-79 additionné de 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal. Pour les courbes de croissance dans des conditions sans glucose, les cellules ont été cultivées dans du milieu SDM-80 avec 10 % de FBS dialysé. Des lignées cellulaires ARNi ont été cultivées en présence de 2,5 μg/ml de phléomycine et de 1 μg/ml de puromycine. Pour la purification de l'ATP synthase, les mitochondries ont été isolées de la souche Lister 427. Typiquement, 1,5 × 1011 cellules ont été récoltées, lavées dans un tampon phosphate de sodium 20 mM pH 7,9 avec 150 mM NaCl et 20 mM glucose, remises en suspension dans un tampon hypotonique 1 mM Tris-HCl pH 8,0, EDTA 1 mM, et interrompu par 10 coups dans un homogénéisateur Dounce de 40 ml. La lyse a été arrêtée par addition immédiate de saccharose à 0,25 M. Les mitochondries brutes ont été culottées (15 min à 16 000 × g, 4 °C), remises en suspension dans du Tris-HCl 20 mM pH 8,0, saccharose 250 mM, MgCl2 5 mM, 0,3 mM CaCl2 et traité avec 5 μg/ml de DNase I. Après 60 min sur glace, un volume de tampon STE (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, saccharose 250 mM, EDTA 2 mM) a été ajouté et les mitochondries ont été culottées (15 min à 16000 ×g, 4 °C). Le culot a été remis en suspension dans 60 % (v/v) de Percoll dans STE et chargé sur six gradients linéaires de 10 à 35 % de Percoll dans STE dans des tubes en polycarbonate pour rotor SW28 (Beckman). Les gradients ont été centrifugés pendant 1 h à 104 000 × g, 4 °C. La phase intermédiaire contenant des vésicules mitochondriales (15 à 20 ml par tube) a été collectée, lavée quatre fois dans le tampon STE et les pastilles ont été congelées instantanément dans de l'azote liquide et stockées à -80 ° C.

Pour réguler négativement les sous-unités d'ATP synthase par l'ARNi, des fragments d'ADN correspondant à des séquences cibles individuelles ont été amplifiés par PCR à partir d'ADN génomique de la souche Lister 427 à l'aide d'amorces directes et inverses étendues avec les sites de restriction XhoI & KpnI et XbaI & BamHI, respectivement (tableau supplémentaire 3). Chaque fragment a été inséré dans les multiples sites de clonage 1 et 2 du vecteur pAZ0055, dérivé de pRPHYG-iSL (courtoisie de Sam Alsford) par remplacement du gène de résistance à l'hygromycine par le gène de résistance à la phléomycine, avec les enzymes de restriction KpnI/BamHI et XhoI/XbaI, respectivement . Les constructions résultantes avec des cassettes d'ARNi induites par la polymérase T7 inductible par la tétracycline ont été linéarisées avec NotI et transfectées dans une lignée cellulaire dérivée de la souche Lister 427 par intégration de la construction SmOx pour l'expression de la polymérase T7 et du répresseur de la tétracycline38 dans le locus β-tubuline. L'ARNi a été induit dans des populations semi-clonales sélectionnées par addition de 1 μg/ml de tétracycline et la régulation négative des ARNm cibles a été vérifiée par RT-PCR quantitative 2 et 4 jours après l'induction. L'ARN total isolé par un kit RNeasy Mini (Qiagen) a été traité avec 2 μg de DNase I, puis transcrit en ADNc avec le kit TaqMan Reverse Transcription (Applied Biosciences). Les réactions qPCR ont été définies avec le mélange maître Light Cycler 480 SYBR Green I (Roche), 2 μl d'ADNc et des amorces 0, 3 μM (tableau supplémentaire 3) et exécutées sur LightCycler 480 (Roche). L'expression relative des gènes cibles a été calculée à l'aide de la méthode -ΔΔCt avec l'ARNr 18S ou la β-tubuline comme gènes de référence endogènes et normalisée par rapport aux cellules non induites.

Des lysats de cellules entières pour l'électrophorèse dénaturante au dodécylsulfate de sodium polyacrylamide (SDS-PAGE) ont été préparés à partir de cellules remises en suspension dans du tampon PBS (tampon phosphate 10 mM, NaCl 130 mM, pH 7,3) par addition de tampon Laemmli 3x (Tris 150 mM pH 6,8, 300 mM 1,4-dithiothréitol, 6 % (p/v) SDS, 30 % (p/v) glycérol, 0,02 % (p/v) bleu de bromophénol) à la concentration finale de 1 × 107 cellules dans 30 μl. Les lysats ont été bouillis à 97°C pendant 10 min et conservés à -20°C. Pour l'immunotransfert, les lysats de 3 × 106 cellules ont été séparés sur des gels de polyacrylamide Tris-glycine à gradient de 4 à 20% (BioRad 4568094), électrotransférés sur une membrane PVDF (Pierce 88518) et sondés avec les anticorps respectifs (tableau supplémentaire 4). Les membranes ont été incubées avec le substrat Clarity Western ECL (BioRad 1705060EM) et la chimiluminescence a été détectée sur un instrument ChemiDoc (BioRad). Les intensités des bandes ont été quantifiées densitométriquement à l'aide du logiciel ImageLab. Les niveaux des sous-unités individuelles ont été normalisés au signal de mtHsp70.

La PAGE native bleue (BN-PAGE) a été réalisée comme décrit plus tôt12 avec les modifications suivantes. Des vésicules mitochondriales brutes de 2,5 × 108 cellules ont été remises en suspension dans 40 µl de tampon de solubilisation A (acide ε-aminocaproïque 2 mM (ACA), EDTA 1 mM, NaCl 50 mM, Bis-Tris/HCl 50 mM, pH 7,0) et solubilisées avec 2 % (p/v) de dodécylmaltoside (β-DDM) pendant 1 h sur de la glace. Les lysats ont été éliminés à 16 000 × g pendant 30 min à 4 ° C et leur concentration en protéines a été estimée à l'aide d'un dosage à l'acide bicinchoninique. Pour chaque instant, un volume de lysat mitochondrial correspondant à 4 μg de protéines totales a été mélangé avec 1,5 μl de colorant de charge (ACA 500 mM, 5 % (p/v) Coomassie Brilliant Blue G-250) et 5 % (p/ v) glycérol et avec 1 M ACA jusqu'à un volume final de 20 μl/puits et résolu sur un gel natif PAGE 3–12% Bis-Tris (Invitrogen). Après l'électrophorèse (3 h, 140 V, 4 °C), les protéines ont été transférées par électrotransfert sur une membrane PVDF (2 h, 100 V, 4 °C, agitation), suivies d'une immunodétection avec un anticorps approprié (tableau supplémentaire 4) .

La capacité à polariser la membrane mitochondriale a été déterminée par fluorimétrie en utilisant le colorant safranine O (Sigma S2255) dans des cellules perméabilisées. Pour chaque échantillon, 2 × 107 cellules ont été récoltées et lavées avec du tampon ANT (KCl 8 mM, K-gluconate 110 mM, NaCl 10 mM, Hepes acide libre 10 mM, K2HPO4 10 mM, sel de potassium EGTA 0,015 mM, mannitol 10 mM , 0,5 mg/ml de BSA sans acide gras, 1,5 mM MgCl2, pH 7,25). Les cellules ont été perméabilisées par 8 μM de digitonine dans 2 ml de tampon ANT contenant 5 μM de safranine O. La fluorescence a été enregistrée pendant 700 s dans un spectrofluorimètre Hitachi F-7100 (Hitachi High Technologies) à une fréquence d'acquisition de 5 Hz, en utilisant 495 et 585 nm longueurs d'onde d'excitation et d'émission, respectivement. 1 mM d'ATP (PanReac AppliChem A1348,0025) et 10 μg/ml d'oligomycine (Sigma O4876) ont été ajoutés après 230 s et 500 s, respectivement. L'addition finale du découpleur SF 6847 (250 nM ; Enzo Life Sciences BML-EI215-0050) a servi de contrôle pour la dépolarisation maximale. Toutes les expériences ont été réalisées à température ambiante et sous agitation constante.

La production d'ATP dans les mitochondries isolées à la digitonine a été réalisée comme décrit précédemment39. En bref, 1 × 108 cellules par point de temps ont été lysées dans du tampon SoTE (sorbitol 600 mM, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7, 75) contenant 0, 015% (p / v) de digitonine pendant 5 min sur glace. Après centrifugation (3 min, 4000 × g, 4 ° C), la fraction cytosolique soluble a été jetée et le culot d'organites a été remis en suspension dans 75 μl de tampon de test de production d'ATP (sorbitol 600 mM, MgSO4 10 mM, tampon phosphate de potassium 15 mM pH 7,4, Tris-HCl 20 mM pH 7,4, 2,5 mg/ml de BSA sans acide gras). La production d'ATP a été induite par l'ajout de phosphate de DL-glycérol 20 mM (sel de sodium) et d'ADP 67 μM. Les échantillons témoins ont été préincubés avec les inhibiteurs cyanure de potassium (1 mM) et carboxyatractyloside (6,5 μM) pendant 10 min à température ambiante. Après 30 min à température ambiante, la réaction est stoppée par addition de 1,5 µl d'acide perchlorique à 70 %. La concentration d'ATP a été estimée à l'aide du kit Roche ATP Bioluminescence Assay HS II dans un lecteur de plaques Tecan Spark. Les valeurs de luminescence des échantillons induits par l'ARNi ont été normalisées à celles de l'échantillon non induit correspondant.

Les échantillons ont été centrifugés et le culot a été transféré sur les porte-échantillons qui ont été complétés avec 20 % de BSA et immédiatement congelés à l'aide d'un congélateur haute pression Leica EM ICE (Leica Microsystems). La substitution par congélation a été effectuée en présence de tétroxyde d'osmium à 2 % dilué dans de l'acétone à 100 % à -90 °C. Après 96 h, les échantillons ont été réchauffés à -20 °C avec une pente de 5 °C/h. Après les 24 h suivantes, la température a été portée à 3 °C (3 °C/h). À température ambiante, les échantillons ont été lavés à l'acétone et infiltrés avec un mélange à 25, 50, 75 % d'acétone/résine EMbed 812 (EMS) 1 h à chaque étape. Enfin, les échantillons ont été infiltrés dans de la résine à 100 % et polymérisés à 60 °C pendant 48 h. Des coupes ultrafines (70 nm) ont été coupées à l'aide d'un couteau en diamant, placées sur des grilles de cuivre et colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb. Des micrographies TEM ont été prises avec une caméra Mega View III (SIS) en utilisant un TEM JEOL 1010 fonctionnant à une tension d'accélération de 80 kV.

Les mitochondries de 3 × 1011 cellules ont été lysées par 1% (w/v) β-DDM dans 60 ml de 20 mM Bis-tris propane pH 8,0 avec 10% de glycérol et des inhibiteurs complets de protéase sans EDTA (Roche) pendant 20 min à 4 °C. Le lysat a été clarifié par centrifugation à 30 000 × g pendant 20 min à 4 ° C et ajusté à pH 6,8 par addition goutte à goutte d'acide 3-(N-morpholino) propanesulfonique 1 M pH 5,9. TbIF1 recombinant sans région de dimérisation, dont l'affinité pour la F1-ATPase a été augmentée par troncature N-terminale et substitution de la tyrosine 36 par du tryptophane20, avec une étiquette C-terminale de glutathion S-transférase (GST) (TbIF1(9-64)-Y36W- GST) a été ajouté en excès molaire d'environ 10 fois par rapport à la teneur estimée en ATP synthase. La liaison de TbIF1 a été facilitée par l'ajout d'ATP 2 mM neutralisé avec du sulfate de magnésium 4 mM. Après 5 min, du chlorure de sodium a été ajouté à 100 mM, le lysat a été filtré à travers un filtre seringue de 0,2 μm et immédiatement chargé sur une colonne GSTrap HP de 5 ml (Cytiva) équilibrée dans un tampon de liaison Bis-Tris-Propane pH 6,8 20 mM contenant 0,1% (p/v) glyco-diosgénine (GDN ; Avanti Polar Lipids), 10 % (v/v) de glycérol, 100 mM de chlorure de sodium, 1 mM de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP), 1 mM d'ATP, 2 mM de magnésium sulfate, 15 μg/ml cardiolipine, 50 μg/ml 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC), 25 μg/ml 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (POPE) et 10 μg/ml de 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-[phospho-rac-(1-glycérol)] (POPG). Tous les phospholipides ont été achetés chez Avanti Polar Lipids (numéros de catalogue 840012C, 850457C, 850757C et 840757, respectivement). L'ATP synthase a été éluée avec un gradient de glutathion réduit 20 mM dans un tampon Tris pH 8,0 contenant les mêmes composants que le tampon de liaison. Les fractions contenant l'ATP synthase ont été regroupées et concentrées à 150 ul sur un concentrateur centrifuge Vivaspin avec un seuil de poids moléculaire de 30 kDa. L'échantillon a été fractionné par chromatographie d'exclusion stérique sur une colonne Superose 6 Augmentation 3,2/300 GL (Cytiva) équilibrée dans un tampon contenant du Tris 20 mM pH 8,0, du chlorure de sodium 100 mM, du chlorure de magnésium 2 mM, du GDN à 0,1 % (p/v). , 3,75 μg/ml de cardiolipine, 12,5 μg/ml de POPC, 6,25 μg/ml de POPE et 2,5 μg/ml de POPG à 0,03 ml/min. Les fractions correspondant à l'ATP synthase ont été regroupées, complétées par 0, 05% (p / v) de β-DDM que nous et d'autres avons trouvé expérimentalement pour mieux préserver les assemblages de dimères dans cryo-EM40, et concentrées à 50 μl.

Les échantillons ont été vitrifiés sur des grilles Quantifoil R1.2/1.3 Au 300 mesh à décharge luminescente après un transfert de 3 s, suivi d'une plongée dans de l'éthane liquide à l'aide d'un Vitrobot Mark IV. 5199 films ont été collectés à l'aide d'EPU 1.9 sur un Titan Krios (ThermoFisher Scientific) fonctionnant à 300 kV à un grossissement nominal de 165 kx (0,83 Å/pixel) avec une caméra Quantum K2 (Gatan) utilisant une largeur de fente de 20 eV. Les données ont été recueillies avec un taux d'exposition de 3,6 électrons/px/s, une exposition totale de 33 électrons/Å2 et 20 images par film.

Le traitement des images a été effectué dans le framework Scipion 241, en utilisant RELION-3.0 sauf indication contraire. Les films ont été corrigés en mouvement à l'aide de l'implémentation RELION du MotionCor2. 294 054 particules ont été initialement sélectionnées à l'aide d'une sélection basée sur des références dans Gautomatch (http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch) et les paramètres de la fonction de transfert de contraste utilisaient GCTF42. Un traitement d'image ultérieur a été effectué dans RELION-3.0 et une classification 2D et 3D a été utilisée pour sélectionner 100 605 particules, qui ont ensuite été extraites dans une boîte de 560 pixels non regroupée (Fig. S1). Un modèle initial du dimère d'ATP synthase a été obtenu en utilisant la génération de modèle 3D de novo. En utilisant un raffinement masqué avec une symétrie C2 appliquée, une structure de 2, 7 Å de la région membranaire a été obtenue après un raffinement CTF par particule et un polissage bayésien. Suite à l'expansion de la symétrie C2 et à la soustraction du signal d'un monomère, une carte de 3,7 Å de la tige périphérique a été obtenue. En utilisant la classification 3D (T = 100) des particules alignées, avec un masque sur la région F1/c-ring, 10 sous-états de rotation différents ont ensuite été séparés et des cartes à une résolution de 3, 5 à 4, 3 Å ont été obtenues à l'aide d'un raffinement 3D. Les auteurs notent que le nombre de classes identifiées dans cette étude reflète probablement le nombre limité de particules, plutôt que l'espace conformationnel complet du complexe. En combinant des particules de tous les états appartenant à l'état de rotation principal 1, une carte de 3, 7 Å du rotor et une carte de consensus de 3, 2 Å du dimère complet d'ATP synthase avec les deux rotors dans l'état de rotation principal 1 ont été obtenues.

Un modèle atomique initial de la région membranaire Fo statique a été construit automatiquement à l'aide de Bucaneer43. Les sous-unités ont ensuite été attribuées directement à partir de la carte cryo-EM, 15 d'entre elles correspondant aux sous-unités d'ATP synthase de T. brucei précédemment identifiées21, tandis que trois sous-unités (ATPTB14, ATPEG3 et ATPEG4) ont été identifiées ici à l'aide de recherches BLAST. La construction manuelle du modèle a été réalisée dans Coot 0.9.544 en utilisant le T. brucei F1 PDB 6F5D [https://www.rcsb.org/structure/6F5D] (T. brucei F1)13 et les modèles d'homologie45 du E. gracilis OSCP et c-ring PDB 6TDU [https://www.rcsb.org/structure/6TDU] (E. gracilis mitochondrial ATP synthase)10 comme modèles de départ. Les ligands ont été ajustés manuellement à la carte et les contraintes ont été générées par le serveur GRADE (http://grade.globalphasing.org). Les cardiolipines ont été attribuées sur la base de la présence d'une densité allongée caractéristique ramifiée aux deux extrémités, correspondant à deux groupes phosphatidyle liés par le pont glycérol central. Les lipides monophosphatidyles ont été attribués en fonction de leurs densités de groupe de tête. Les formes tétraédriques caractéristiques des densités de groupes choline ont servi à distinguer les phosphatidylcholines des groupes de tête allongés de phosphatidyléthanolamine (Fig. 5g, h supplémentaires). Le raffinement de l'espace réel a été effectué dans PHENIX 1.17.1 à l'aide de cartes auto-affinées et filtrées à résolution locale de la région de la membrane, de la pointe de la tige périphérique, de l'anneau en C / de la tige centrale et des monomères F1Fo dans différents états de rotation, respectivement, en utilisant des monomères secondaires. contraintes structurelles. Les statistiques du modèle ont été générées à l'aide de MolProbity46 et d'EMRinger47 Enfin, les modèles raffinés respectifs ont été combinés dans un modèle composite de dimère d'ATP synthase et raffinés dans l'espace réel par rapport à la carte consensuelle de dimère d'ATP synthase filtrée à résolution locale avec les deux monomères dans l'état de rotation 1, en appliquant la référence contraintes. Les figures des structures ont été préparées à l'aide de ChimeraX 0.9148, les demi-canaux de protons ont été tracés à l'aide de HOLLOW49.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les coordonnées atomiques générées dans cette étude ont été déposées dans la Protein Data Bank (PDB) sous les codes d'accès : 8AP7 (région membranaire), 8AP8 (tige périphérique), 8AP9 (rotor), 8AP6 (dimère F1Fo), 8APA (rotational état 1a), 8APB (état de rotation 1b), 8APC (état de rotation 1c), 8APD (état de rotation 1d), 8APE (état de rotation 1e), 8APF (état de rotation 2a), 8APG (état de rotation 2b), 8APH (état de rotation 2c), 8APJ (état de rotation 2d), 8APK (état de rotation 3). Les cartes cryo-EM filtrées à résolution locale, les demi-cartes, les masques et les courbes FSC ont été déposées dans la banque de données de microscopie électronique sous les codes d'accession : EMD-15560 (région membranaire), EMD-15561 (tige périphérique), EMD-15562 (rotor), EMD-15559 (dimère F1Fo), EMD-15563 (état de rotation 1a), EMD-15564 (état de rotation 1b), EMD-15565 (état de rotation 1c), EMD-15566 (état de rotation 1d), EMD- 15567 (état de rotation 1e), EMD-15568 (état de rotation 2a), EMD-15570 (état de rotation 2b), EMD-15571 (état de rotation 2c), EMD-15572 (état de rotation 2d), EMD-15573 (état de rotation 3 ). Les micrographies TEM de sections de cellules minces sont disponibles auprès des auteurs sur demande. Toutes les autres données sont disponibles dans l'article, les informations supplémentaires ou le fichier de données source. Les données sources sont fournies avec ce document.

Les coordonnées atomiques qui ont été utilisées dans cette étude : 6TDU (E. gracilis mitochondrial ATP synthase), 6TDV (E. gracilis mitochondrial ATP synthase, région membranaire), 6B2Z (S. cerevisiae mitochondrial ATP synthase), 6F5D (T. brucei F1) , 6ZNA (S. scrofa mitochondrial ATP synthase) Les données sources sont fournies avec cet article.

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Nous sommes reconnaissants à John E. Walker et Martin G. Montgomery pour leur aide inestimable avec la purification de l'ATP synthase dans la phase initiale du projet. Nous reconnaissons l'installation centrale de cryo-microscopie électronique et de tomographie du CIISB, Instruct-CZ Centre, soutenue par MEYS CR (LM2018127). Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation tchèque pour la science numéro 18-17529S à AZ et 20-04150Y à OG et par le Fonds européen de développement régional (FEDER) et le projet CZ.02.1.01/0.0 du ministère de l'Éducation, de la Jeunesse et des Sports (MEYS). /0.0/16_019/0000759 à AZ, Fondation suédoise pour la recherche stratégique (FFL15:0325), Fondation Ragnar Söderberg (M44/16), Conseil européen de la recherche (ERC-2018-StG-805230), Fondation Knut et Alice Wallenberg (2018.0080) , et EMBO Young Investigator Program à AA

Financement en libre accès fourni par l'Université de Stockholm.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Ondřej Gahura, Alexander Mühleip.

Institut de parasitologie, Centre de biologie, Académie tchèque des sciences, 37005, České Budějovice, République tchèque

Ondřej Gahura, Carolina Hierro-Yap, Brian Panicucci, Minal Jain, Martina Slapničková & Alena Zíková

Science for Life Laboratory, Département de biochimie et de biophysique, Université de Stockholm, 17165, Solna, Suède

Alexander Mühleip & Alexey Amunts

Faculté des sciences, Université de Bohême du Sud, 37005, České Budějovice, République tchèque

Carolina Hierro-Yap, Minal Jain, David Hollaus et Alena Zíková

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AZ et AA ont conçu et conçu l'œuvre. OG a préparé l'échantillon pour cryo-EM. OG et AM ont effectué le dépistage initial. AM a traité les données cryo-EM et construit le modèle. OG, AM et AA ont analysé la structure. BP, CHY, MJ, MS, OG, DH et AZ ont effectué une analyse biochimique. OG, AM, AA et AZ ont interprété les données. OG, AM, AA et AZ ont rédigé et révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont contribué à l'analyse et ont approuvé la version finale du manuscrit.

Correspondance à Alena Zíková ou Alexey Amunts.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Gahura, O., Mühleip, A., Hierro-Yap, C. et al. Un module d'interaction ancestral favorise l'oligomérisation dans des ATP synthases mitochondriales divergentes. Nat Commun 13, 5989 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33588-z

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Reçu : 22 décembre 2021

Accepté : 22 septembre 2022

Publié: 11 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-33588-z

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