La pseudoiodinine de pyrazolotriazine naturelle de Pseudomonas mosselii 923 inhibe les pathogènes bactériens et fongiques des plantes

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 734 (2023) Citer cet article

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Les produits naturels produits en grande partie par des micro-organismes du sol de type Pseudomonades sont une source constante de métabolites antimicrobiens et de pesticides. Nous rapportons ici l'isolement de la souche 923 de Pseudomonas mosselii à partir des sols de la rhizosphère de riz des rizières, qui inhibent spécifiquement la croissance des bactéries pathogènes des plantes Xanthomonas et de l'agent pathogène fongique Magnaporthe oryzae. Le composé antimicrobien est purifié et identifié comme pseudoiodinine à l'aide de spectres de masse à haute résolution, de résonance magnétique nucléaire et de diffraction des rayons X sur monocristal. La mutagenèse aléatoire à l'échelle du génome, l'analyse du transcriptome et les essais biochimiques définissent le groupe biosynthétique de pseudoiodinine comme psdABCDEFG. Il est proposé d'initier la biosynthèse de la pseudoiodinine à partir de la guanosine triphosphate et la 1,6-didesméthyltoxoflavine est un intermédiaire biosynthétique. La mutagenèse transposon indique que GacA est le régulateur global. De plus, deux petits ARN non codants, rsmY et rsmZ, régulent positivement la transcription de la pseudoiodinine, et les régulateurs de stockage de carbone CsrA2 et CsrA3, qui régulent négativement l'expression de psdA. Une augmentation de 22,4 fois de la production de pseudoiodinine est obtenue en optimisant les milieux utilisés pour la fermentation, en surexprimant l'opéron biosynthétique et en supprimant les sites de liaison CsrA. La souche 923 et la pseudoiodinine purifiée in planta inhibent les agents pathogènes sans affecter le riz hôte, ce qui suggère que la pseudoiodinine peut être utilisée pour lutter contre les maladies des plantes.

Le riz (Oryza sativa L.) est une culture de base d'importance mondiale et est considéré comme une culture stratégique pour la sécurité alimentaire par l'Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO)1 ; malheureusement, la production de riz est entravée par de multiples contraintes, notamment des maladies dévastatrices, telles que la brûlure bactérienne des feuilles (BLB), la striure bactérienne des feuilles (BLS) et la pyriculariose qui sont provoquées par Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), X. oryzae pv. oryzicola (Xoc) et Magnaporthe oryzae, respectivement2,3. Actuellement, la culture de variétés de riz avec des gènes de résistance aux maladies (R) semble être une meilleure option pour contrôler X. oryzae que d'autres schémas de gestion2,4 ; cependant, les cultivars plantés en Chine sont généralement sensibles aux agents pathogènes5. Bien que les fongicides et bactéricides chimiques soient fréquemment utilisés pour lutter contre les maladies du riz6, leur utilisation a entraîné une pollution, une résistance aux médicaments et une résurgence de pathogènes7,8. Une approche de contrôle respectueuse de l'environnement est l'utilisation potentielle de bactéries antagonistes comme agents de lutte biologique (BCA) capables de supprimer les agents pathogènes en produisant des métabolites secondaires bioactifs, notamment des antibiotiques, des sidérophores et des composés volatils9.

Les produits naturels (NP) sont une source constante de métabolites antimicrobiens et de médicaments potentiels et sont en grande partie produits par des micro-organismes vivant dans le sol10,11. Les espèces de Pseudomonas sont des bactéries gram-négatives qui persistent dans le sol, l'eau, les animaux et la rhizosphère des plantes. Les pseudomonades produisent de nombreuses NP antimicrobiennes, notamment la phénazine, des dérivés du pyrrole, le 2,4-diacétylphloroglucinol (2,4-DAPG) et des substances favorisant la croissance, ce qui les rend bien adaptées au stress environnemental et utilisables comme BCA des agents pathogènes des plantes12. De nombreux métabolites secondaires de Pseudomonas sont régulés par le système à deux composants GacS/GacA (TCS)13, les petits ARN non codants (ARNs) et les protéines CsrA/RsmA14. Avec l'avènement du séquençage génomique, de nombreux antimicrobiens ont été découverts dans le microbiome mondial15 avec des avantages pour l'agriculture moderne16 et la santé humaine17. Cependant, le développement en cours d'agents pathogènes multirésistants18 a accru l'urgence de découvrir de nouvelles NP pour contrôler les maladies bactériennes et fongiques des cultures.

Des membres de la famille des hétérocycles naturels pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazine ont été isolés et caractérisés au cours des 40 dernières années19, notamment les fluviols20, la nostocine A21 et la pseudoiodinine22. La structure de la pseudoiodinine contient un fragment 1,2,4-triazine fusionné avec un cycle pyrazole et deux groupes méthyle. Les dérivés de la famille des pyrazolotriazines présentent un large éventail de fonctions biologiques, notamment des activités antitumorales, antivirales et antibactériennes23,24. En particulier, la pseudoiodinine a montré de fortes activités antinéoplutiques contre le sarcome25. Fait intéressant, la voie biosynthétique et les groupes de gènes biosynthétiques (BGC) de la pseudoiodinine n'ont pas été élucidés et restent une riche ressource pour la biologie synthétique et le développement de dérivés bioactifs.

Dans ce travail, la souche 923 de P. mosselii est criblée pour l'inhibition de X. oryzae et M. oryzae, et le composé antagoniste est identifié comme pseudoiodinine. L'opéron biosynthétique responsable de l'assemblage de la pseudoiodinine est identifié. La guanosine triphosphate (GTP) s'avère être un précurseur et la 1,6-didesméthyltoxoflavine (1,6-DDMT) est un intermédiaire biosynthétique de la pseudoiodinine. Il a été démontré que la régulation de la pseudoiodine est médiée par GacA, rsmY/Z et CsrA123, conduisant à générer génétiquement une souche surproductrice de pseudoiodine. Les résultats montrent que la pseudoiodinine est efficace pour contrôler les maladies bactériennes et fongiques du riz, élargissant ainsi la gamme d'options potentielles pour contrôler les agents pathogènes du riz.

Il est bien établi que les plantes recrutent des bactéries bénéfiques pour supprimer les agents pathogènes dans la rhizosphère26. Ainsi, nous avons étudié si les bactéries du sol peuvent supprimer la croissance des agents pathogènes du riz Xoo PXO99A, Xoc RS105 et M. oryzae R01-1. Un total de 223 isolats bactériens cultivables ont été obtenus à partir de 248 échantillons de rhizosphère prélevés dans 23 provinces de Chine ; ceux-ci ont été examinés pour l'activité antagoniste in vitro. Un isolat bactérien nommé 923 a montré une forte activité inhibitrice contre Xoo PXO99A, Xoc RS105 et M. oryzae R01-1 (Fig. 1a, b), et l'inhibition était généralement plus importante pour les souches de Xoo que Xoc (Fig. 1a, b supplémentaire) . De plus, la souche 923 a montré des niveaux variables d'antagonisme envers 11 autres agents pathogènes de Xanthomonas (Fig. 1c supplémentaire).

a, b Activité antagoniste de la souche 923 vis-à-vis de Xoo PXO99A, Xoc RS105 et M. oryzae isoler R01-1 dans des essais de co-culture, la souche 923 non traitée a été utilisée comme contrôle (CK). c Longueurs des lésions Xoc RS105-Gus sur du riz Yuanfengzao inoculé avec la souche 923, ΔpsdA ou 923 SUP à 7 jours post-inoculation (dpi) en serre. 'Pre' représente des feuilles de riz prétraitées avec de l'eau (MOCK-Pre), 923, ΔpsdA ou 923 SUP (surnageant) avant l'inoculation du pathogène ; 'Tre' représente des feuilles de riz inoculées avec Xoc RS105-Gus puis traitées avec de l'eau (MOCK-Tre), 923, ΔpsdA ou 923 SUP. d Dynamique des populations de Xoc RS105-Gus dans les feuilles de riz. Les populations bactériennes ont été contrôlées par la quantification GUS et la coloration histochimique à 7 dpi. Les barres d'erreur montrent les moyennes ± SD (n = 3 feuilles indépendantes) et les différences significatives à ***P < 0,001, ***P = 6,4 × 10−14, = 3,2 × 10−15, = 8,3 × 10−15, = 5,5 × 10−16 en séquence de c, ***P < 0,001, ***P = 1,3 × 10−25, = 2,4 × 10−26, = 1,8 × 10-25, = 3,6 × 10-26 en séquence de d, ns non significatif (P > 0,05). e, f Zones de lésions de la maladie sur du riz de plein champ inoculé avec la souche 923 et (e) Xoo PXO99A ou (f) Xoc RS105. Les zones de lésion ont été déterminées à 15 dpi (n = 15 feuilles indépendantes, moyennes ± SD), ***P < 0,001, ***P = 1,2×10−15, = 1,3×10−14 en séquence de e ; ***P < 0,001, ***P = 4,7 × 10−13, = 3,2 × 10−11 en séquence de f ; ns, non significatif (P > 0,05). La signification statistique des zones de lésion inoculées avec Xoc ou Xoo a été déterminée à l'aide de la méthode de test LSD et d'une ANOVA unidirectionnelle ; La barre centrale représente la moyenne, et Min à Max de la boîte et des moustaches a été utilisé. Les expériences ont été répétées trois fois indépendamment avec des résultats similaires.

Pour déterminer si la souche 923 inhibait la croissance de Xoo et Xoc in planta, des expériences de lutte biologique ont été menées en serre. Lorsque la souche 923 ou le surnageant (SUP) a été appliqué en tant que prétraitement (Pre), la longueur des lésions était d'environ 50 % inférieure à celle du témoin (Fig. 1c), ce qui était cohérent avec les résultats quantitatifs du test GUS (Fig. 1d ). De plus, le pré- et le post-traitement avec la souche 923 ont entraîné des lésions significativement plus petites, causées respectivement par Xoo et Xoc, sur les feuilles de riz au champ (Fig. 1e, f). Ces résultats suggèrent que la souche 923 est un agent de biocontrôle (BCA) efficace pour les pathogènes bactériens.

Plusieurs approches ont été utilisées pour identifier la souche 923. L'analyse phylogénétique des séquences d'ARNr 16S a montré que 923 était un membre du genre Pseudomonas et regroupé avec P. mosselii DSM17497, qui était similaire à 99, 6% (Fig. 2b supplémentaire). Pour confirmer davantage la classification taxonomique de la souche 923, le génome entier a été séquencé (Fig. 2a supplémentaire). L'analyse de l'identité nucléotidique moyenne (ANI) basée sur le génome a indiqué que le génome 923 avait une valeur ANI de 99,25 % par rapport à P. mosselii DSM17497 ; ceci est supérieur à la valeur seuil de 95% pour la démarcation des espèces, confirmant que la souche 923 est P. mosselii. Des tests phylogénomiques supplémentaires ont confirmé ces conclusions (Fig. 2c supplémentaire).

Les bactéries productrices d'antibiotiques produisent généralement des zones d'inhibition lorsqu'elles sont déposées sur un milieu recouvert d'un agent pathogène cible27. Nous avons préparé des extraits des cultures de la souche 923 avec une variété de solvants organiques et les avons déposés sur des plaques ensemencées avec Xoo PX099A. Les extraits d'acétate d'éthyle ont produit les plus grandes zones d'inhibition lorsqu'ils ont été déposés sur la superposition Xoo PX099A (Fig. 3a supplémentaire). De plus, l'extrait d'acétate d'éthyle a été soumis à une colonne de gel de silice en phase inverse C18 pour donner douze fractions, étiquetées A1-A12. Sur la base du profil de bioactivité, les fractions A1 et A5-A6 ont été purifiées davantage par HPLC préparative sur une colonne C18 pour donner les composés PM-1 à PM-7 (Fig. 2a et Fig. 3a supplémentaire). Parmi les sept composés purifiés, seul le PM-3 a présenté une activité inhibitrice significative pour Xoo PX099A (Fig. 2b). La formule moléculaire de PM-3 a été déterminée comme étant C6H7N5O par spectres de masse à haute résolution (HRMS) (m/z 166,0722 [M + H]+, calculé pour C6H8N5O, 166,0729) (Fig. 4 supplémentaire). Les données de résonance magnétique nucléaire (RMN) (Fig. 5 à 8 supplémentaires) et la diffraction des rayons X sur monocristal (Fig. 2c et Tableau supplémentaire 1) ont confirmé la structure de PM-3, qui était identique à la pseudoiodinine. De plus, PM-3 (pseudoiodinine) a démontré son efficacité contre de nombreuses autres espèces pathogènes de Xanthomonas, y compris X. campestris pv. phaseoli, X. campestris pv. malvacearum et X. citri subsp. citri (Fig. 3d supplémentaire).

un organigramme pour l'extraction et l'isolement des composés de la souche 923 qui ont inhibé PXO99A. Les abréviations et les structures sont les suivantes : PE, éther de pétrole ; EtOAc, acétate d'éthyle; NBA, alcool n-butylique; MeOH, méthanol; composés : PM-1, C16H18N2O ; PM-2, C15H16N2O ; PM-3, C6H7N5O ; PM-4, C15H16N2O2 ; PM-5, C5H5N5O ; PM-6, C16H26O3 ; et PM-7, C18H30O3. b L'activité antibactérienne des composés PM-1 à PM-7 pour Xoo PXO99A ; le méthanol a été utilisé comme contrôle négatif. c Dessin radiographique ORTEP pour PM-3.

Les dosages MIC (concentration minimale inhibitrice) et EC50 (concentration efficace pour 50% d'inhibition) ont montré que la pseudoiodinine était plus toxique pour Xoo PX099A et Xoc RS105 que les 11 autres Xanthomonas spp. avec des CMI de 0,5 et 4 μg/mL et des valeurs de CE50 de 0,17 et 1,36 μg/mL, respectivement (Fig. 9a, b et tableau 1 supplémentaires). La pseudoiodinine a également inhibé la croissance de M. oryzae R01-1 avec des valeurs de CMI et de CE50 de 8,25 et 4,43 μg/mL, respectivement (Fig. 9c supplémentaire).

Des études antérieures ont démontré que l'acide phénazine-1-carboxylique (PCA ; également connu sous le nom de Shenqinmycin) était un bactéricide efficace pour le contrôle de la BLB et de la BLS en Chine28,29. Étonnamment, nos résultats montrent que les valeurs MIC et EC50 de la pseudoiodinine étaient significativement inférieures à celles de la PCA (tableau 1), ce qui confirme davantage le potentiel de la pseudoiodinine en tant que biopesticide respectueux de l'environnement.

P. mosselii 923 et la pseudoiodinine ont été examinés pour leur capacité à inhiber les agents pathogènes Xoc et Xoo et il a été démontré qu'ils réduisaient de manière significative la zone de lésion des feuilles de riz à 15 dpi (Fig. 10a – c supplémentaires). Pendant ce temps, la mesure de la population bactérienne dans les feuilles de riz a indiqué que les traitements Tre (traitement) ou Pré réduisaient considérablement la colonisation par Xoo et Xoc à 14 et 21 dpi (Fig. 10b – d supplémentaires). Afin d'identifier si la pseudoiodinine est suffisante pour protéger les feuilles de riz des lésions, nous avons retesté l'activité de biocontrôle des mutants ΔpsdA et WT de P. mosselii 923 sur des semis de riz et des plantes adultes. Les feuilles inoculées avec le mutant de délétion ΔpsdA présentaient des longueurs de lésion et une activité GUS équivalentes au traitement MOCK (Fig. 1c, d). Parallèlement, nous avons testé les effets du mutant ΔpsdA, WT P. mosselii 923 et de la pseudoiodinine sur l'inhibition de la croissance de Xoo in planta. Comme prévu, le mutant de délétion ΔpsdA a induit des lésions de taille similaire au traitement MOCK (Fig. 11 supplémentaire), ce qui implique que seule la pseudoiodinine contribue à la protection des plantes. L'efficacité de la pseudoiodinine a été analysée plus en détail en appliquant des concentrations de 0 à 20 μM et en évaluant la maladie dans du riz cultivé au champ inoculé avec Xoo PXO99A en pré- ou post-traitement. La pseudoiodinine à des concentrations> 5 μM a entraîné une réduction significative de la taille des lésions (Fig. 3b, c supplémentaires), indiquant que la pseudoiodinine inhibe efficacement la croissance de Xoo PXO99A et Xoc RS105 dans les tissus de riz. Fait intéressant, nous avons observé que la pseudoiodinine réduisait également de manière significative la zone de lésion de la pyrale causée par le champignon M. oryzae R01-1 (Fig. 12 supplémentaire). Les données ci-dessus démontrent que le composé est un biopesticide prometteur à la fois pour les maladies bactériennes et fongiques du riz.

Bien que la pseudoiodinine ait été identifiée pour la première fois chez P. fluorescens var. pseudoiodinine22, les gènes impliqués dans sa synthèse n'ont pas été caractérisés. Le génome de P. mosselii 923 a été analysé pour les métabolites secondaires à l'aide du programme antiSMASH30 (https://antismash.secondarymetabolites.org/). Cependant, il n'était pas certain quel groupe était associé à la biosynthèse de pseudoiodinine.

Pour identifier les gènes de la voie pseudoiodinine, le système de transposome EZ-Tn5 a été utilisé pour générer des mutations aléatoires dans P. mosselii 923. Environ 10 000 mutants de la souche 923 ont été criblés pour l'activité antimicrobienne envers Xoo PXO99A, et le mutant 34-6 était dépourvu de activité antagoniste in vitro (Fig. 3a). L'emplacement de l'insertion de Tn5 à copie unique dans le mutant 34-6 cartographié sur gacA dans le génome (Fig. 3a); fait intéressant, gacA code pour un régulateur de réponse hautement conservé chez Pseudomonas spp. et appartient à la famille des systèmes de régulation à deux composantes (TCS)13. Pour confirmer davantage la fonction de gacA dans la synthèse de pseudoiodinine, nous avons généré un mutant knock-out sans marqueur où le gacA complet a été supprimé de P. mosselii 923 par double recombinaison homologue. La production de pseudoiodinine a été abolie dans le mutant résultant, qui a été désigné ΔgacA (Fig. 13b, c supplémentaires). La complémentation du mutant ΔgacA avec gacA en trans a restauré l'activité antibactérienne et la production de pseudoiodinine au niveau de type sauvage, mais la surproduction de gacA en trans n'a pas augmenté la production de pseudoiodinine dans la souche 923 (Fig. 13a – c supplémentaires). Ces résultats suggèrent que GacA régule la biosynthèse de la pseudoiodinine, ce qui est cohérent avec le rôle de GacA dans la régulation d'autres métabolites secondaires chez Pseudomonas13,31,32.

un mutant 34–6 de P. mosselii 923 n'a pas d'activité antimicrobienne pour Xoo PXO99A et contient une insertion Tn5 dans gacA. b Tests d'activité antibactérienne des mutants P. mosselii 923, ΔpsdA, ΔpsdB, ΔpsdC, ΔpsdD, ΔpsdE, ΔpsdF et ΔpsdG et leurs souches complémentées correspondantes (CΔpsdA - CΔpsdG). c Analyse HPLC (méthode B, détectée à 500 nm) des mutants ΔpsdA, ΔpsdB, ΔpsdC, ΔpsdD, ΔpsdE, ΔpsdF et ΔpsdG. d Analyse HPLC (Méthode B, détectée à 500 nm) des mutants complémentés CΔpsdA - CΔpsdG. e Schéma du groupe de gènes biosynthétiques de pseudoiodinine chez P. mosselii 923. Les nombres au-dessus des noms de gènes indiquent la longueur ORF. Les couleurs indiquent les fonctions des gènes comme suit : rouge, gènes biosynthétiques primaires ; gris, gènes biosynthétiques supplémentaires. Les sept annotations génétiques sont affichées comme suit : psdA, méthyltransférase de type 12 ; psdB, protéine de la superfamille des dioxygénases de la protéine de résistance à la bléomycine glyoxylase; psdC, protéine facteur de modification de la sulfatase; psdD, GTP cyclohydrolase; psdE, protéine de répétition WD-40 ; psdF, domaine méthyltransférase; psdG, protéine de biosynthèse de la riboflavine RibD.

Pour mieux identifier le groupe de gènes biosynthétiques responsables de la production de pseudoiodinine, les transcriptomes de P. mosselii 923 (WT) et le mutant knock-out ΔgacA (KO) ont été comparés. Ce résultat a révélé que 604 gènes étaient régulés à la baisse dans le mutant gacA (Fig. 13d, e supplémentaire); et 29 gènes exprimés de manière différentielle (DEG) étaient fortement régulés positivement dans le WT par rapport au mutant KO (Fig. 14 supplémentaire et Tableau supplémentaire 2). Pour vérifier les données d'ARN-seq, quinze DEG ont été sélectionnés au hasard pour une confirmation secondaire par analyse RT-qPCR (Fig. 15 supplémentaire). Dix-neuf gènes ont été clonés dans le vecteur suicide p2P24Km et sont répertoriés dans les données supplémentaires 1 sous la forme p24-orf2059 - p24-orf2077. La suppression de ces 19 gènes a entraîné des mutants de P. mosselii Δorf2059 – Δorf2077 (Données supplémentaires 1). Les 19 mutants ont été criblés pour l'activité antimicrobienne et la biosynthèse de la pseudoiodinine, et sept mutants (Δorf2064–Δorf2070) ont été altérés dans la production de pseudoiodinine et défectueux dans l'activité antimicrobienne. Ces sept mutants ont été renommés comme suit : ΔpsdA (Δorf2064) ; ΔpsdB (Δorf2065); ΔpsdC, (Δorf2066); ΔpsdD (Δorf2067); ΔpsdE (Δorf2068); ΔpsdF (Δorf2069); et ΔpsdG (Δorf2070). Les sept gènes codant pour la pseudoiodinine, à savoir psdA, psdB, psdC, psdD, psdE, psdF et psdG, ont été clonés dans le plasmide pBSPPc en aval du promoteur psdA, ce qui a donné pBS-psdA, pBS-psdB, pBS-psdC, pBS-psdD , pBS-psdE, pBS-psdF et pBS-psdG, respectivement. Ces clones ont été transformés en sept mutants correspondants pour obtenir les souches complémentées correspondantes (CΔpsdA-CΔpsdG), qui ont été sauvées pour leur activité antibactérienne et la production de pseudoiodinine (Fig. 3b – d).

La RT-PCR a confirmé que psdABCDEFG dans le groupe de gènes psd provenait d'un seul opéron (Fig. 3e et Fig. 13f supplémentaire). Ce cluster (psdABCDEFG) a été validé par expression hétérologue dans P. putida KT2440. Le psdABCDEFG sous promoteur natif confère à P. putida KT2440 la capacité de produire de la pseudoiodinine, montrant que les sept gènes sont suffisants (Fig. 4a).

un cluster biosynthétique de pseudoiodinine dans la construction pBSPPc-ABCDEFG et analyse HPLC (méthode B, détectée à 500 nm) des extraits de fermentation de WT, KT2440 et de la souche d'expression hétérologue modifiée et de l'échantillon standard (pseudoiodinine). Standard, pseudoiodinine isolée de P. mosselii 923; WT, type sauvage P. mosselii 923; KT2440, P. putida; et KT2440/pBSPPc-ABCDEFG, P. putida contenant le groupe de gènes de pseudoiodinine dans pBSPPc. b Voie proposée pour la biosynthèse de la pseudoiodinine. 1 : 2,5-diamino-6-(5-phospho-d-ribosylamino)pyrimidine-4(3H)-one ; 2 : 5-amino-6-(5-phospho-d-ribitylamino)uracile ; 3 : 5-amino-6-d-ribitylaminouracile ; 1,6-DDMT : 1,6-didésméthyltoxoflavine.

D'autres résultats d'analyse d'homologie ont montré que le groupe de gènes psdABCDEFG était conservé dans d'autres pseudomonades ; en particulier dans la souche type P. mosselii DSM17497, qui présente une similitude d'acides aminés de 99% (Fig. 16 supplémentaire). Cependant, P. mosselii DSM17497 n'a pas produit de niveaux détectables de pseudoiodinine et n'a pas inhibé Xoo PXO99A (Fig. 17a, b supplémentaires). En complément de l'opéron psd DSM17497 (orf2184-orf2190) chez les mutants P. mosselii 923 ΔpsdB, ΔpsdC et ΔpsdG, respectivement, l'activité bactériostatique et la production de pseudoiodinine peuvent être restaurées au niveau 923 de type sauvage (Fig. 17a, b supplémentaires). De plus, les sept gènes de orf2184-orf2190 ont été exprimés dans P. mosselii DSM17497 (Fig. 17c supplémentaire), indiquant que le groupe de gènes pseudoiodinine a été transcrit dans P. mosselii DSM17497. Les résultats ci-dessus ont indiqué que le groupe de gènes psdABCDEFG était fonctionnel dans le P. mosselii DSM17497, mais l'absence de production de pseudoiodinine justifie une étude plus approfondie.

L'analyse BLAST a montré que les séquences d'acides aminés de PsdD et PsdG présentent une similitude significative avec la GTP cyclohydrolase II et la désaminase, respectivement, qui sont impliquées dans la synthèse de la riboflavine et de la toxoflavine33,34. Compte tenu de la corrélation entre les structures de la pseudoiodinine et de la 1,6-didesméthyltoxoflavine (1,6-DDMT), nous présentons une voie de biosynthèse hypothétique pour la pseudoiodinine basée sur la similitude avec la biosynthèse de la toxoflavine33 (Fig. 4b). Dans la voie proposée, PsdD et PsdG utilisent GTP pour générer 2,5-diamino-6-(5-phospho-d-ribosylamino) pyrimidine-4(3H)-one (structure 1, Fig. 4b) et 5-amino- 6-(5-phospho-d-ribitylamino) uracile (structure 2, Fig. 4b) dans les deux premières étapes. Ensuite, soit PsdE et / ou PsdC médient la formation de la formation de liaison N – N en catalysant la conjugaison de la structure 2 ou le produit déphosphorylé 5-amino-6-d-ribitylaminouracile (structure 3, Fig. 4b) avec de la glycine pour générer 1 ,6-DDMT. Enfin, le 1,6-DDMT serait soumis à une séquence d'étapes de contraction du cycle et de méthylation pour produire de la pseudoiodinine. Bien que le 1,6-DDMT n'ait pas été observé dans les souches de P. mosselii 923 de type sauvage ou mutantes, la production de pseudoiodinine a été restaurée lorsque le 1,6-DDMT a été administré aux souches mutantes ΔpsdC et ΔpsdE (Fig. 18 supplémentaire), démontrant que Le 1,6-DDMT est un intermédiaire clé.

Le GacS/GacA TCS contrôle l'expression de gènes impliqués dans la biosynthèse de multiples composés antimicrobiens et enzymes lytiques35. En réponse à des stimuli, GacS s'autophosphoryle et active le régulateur de réponse GacA par phosphotransfert31. GacA active l'expression des ARNs rsmX, rsmY et rsmZ en se liant à une séquence d'activation conservée en amont (UAS) TGTAAGNNATNNCTTACA32 qui régule l'expression des gènes cibles.

Chez P. mosselii 923, deux petits ARN non codants, rsmY et rsmZ, contenaient le motif de liaison à GacA (5'TGTAAGCNAANGCTTACA3') dans leurs régions promotrices (Fig. 19b, c supplémentaires). Pour étudier l'interaction potentielle de rsmY et rsmZ avec GacA, cette dernière a été surproduite dans E. coli BL21 (DE3), purifiée et s'est avérée se lier aux régions promotrices rsmY et rsmZ dans les tests de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) (Fig. 19a supplémentaire -c). Fait intéressant, GacA n'a pas interagi avec le promoteur psdA (données non présentées). Des délétions dans rsmY et rsmZ ont été construites pour étudier plus avant leurs rôles dans la production et l'activité de pseudoiodinine. Les mutants individuels ΔrsmY et ΔrsmZ n'ont eu aucun effet sur l'activité antibactérienne ; cependant, le double mutant ΔrsmYZ était presque complètement dépourvu d'activité antibactérienne contre Xoo PXO99A (Fig. 5a). L'activité antibactérienne a été restaurée à des niveaux de type sauvage dans les trois souches complémentées, à savoir CΔrsmY, CΔrsmZ et CΔrsmYZ (Fig. 5a). La production de pseudoiodinine était significativement réduite chez le mutant ΔrsmY, mais pas chez le mutant ΔrsmZ. Comme prédit à partir des dosages antibactériens, le double mutant ΔrsmYZ n'a pas produit de pseudoiodinine. Les deux souches complémentées (CΔrsmY et CΔrsmZ) ont été partiellement sauvées pour la production de pseudoiodinine, tandis qu'une complémentation simultanée avec rsmY et rsmZ a restauré la production de pseudoiodinine à des niveaux de type sauvage (Fig. 5b, c). Ces données indiquent que GacA régule positivement la biosynthèse de la pseudoiodinine en se liant directement aux promoteurs rsmY et rsmZ, ce qui active la transcription de l'opéron chez P. mosselii 923.

a Essais d'activité antibactérienne des mutants P. mosselii 923, ΔrsmY, ΔrsmZ et ΔrsmYZ et des mutants complémentés CΔrsmY, CΔrsmZ et CΔrsmYZ. Panneaux b, d, profils HPLC (Méthode B, détectée à 500 nm) des souches mutantes et complémentées par rapport au 923 sauvage. Panneaux c, e, production de pseudoiodinine par différentes souches. Les nombres sur les axes y montrent les rendements en pseudoiodinine. c Les mutants de type sauvage 923, rsmY, rsmZ et rsmYZ et leurs souches complémentées correspondantes dans le milieu LB. Les barres d'erreur montrent les moyennes ± SD (n = 3 répétitions biologiques indépendantes) et les différences significatives à ***P < 0,001, ***P = 0,0002, = 2,5 × 10−14, = 1,5 × 10−10 en séquence. e Pseudoiodinine donne dans le type sauvage P. mosselii 923 dans le milieu LB et TSB, les mutants csrA1, csrA2, csrA3, csrA1A2, csrA1A3, csrA2A3 et csrA1A2A3, et les souches surexprimant et permutées RBS dans le milieu TSB. Les barres d'erreur montrent les moyennes ± SD (n = 3 répétitions biologiques indépendantes) et les différences significatives à ***P < 0,001, **P < 0,01, **P = 0,005, ***P = 4,5 × 10−10, = 1,1 × 10−9, = 9,3 × 10−17 en séquence. ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test LSD. Des expériences ont été réalisées trois fois indépendamment avec des résultats similaires. f Modèle proposé de régulation médiée par GacA/CsrA de la biosynthèse de la pseudoiodinine chez P. mosselii 923. Dans la souche 923, le GacS/GacA TCS répond à des signaux non caractérisés et GacA active la transcription de deux ARN non codants (rsmY et rsmZ) en se liant à leurs promoteurs, régulant ainsi positivement la production de pseudoiodinine. Les deux homologues CsrA/RsmA, CsrA2 et CsrA3, inhibent l'initiation de la synthèse de pseudoiodinine. CsrA2 et CsrA3 interagissent principalement avec les séquences/boucles contenant GGA dans la région 5' non traduite des ARNm psdA ; ce site chevauche le RBS et interfère avec la traduction du transcrit psdA. RsmY et RsmZ contiennent plusieurs sites de liaison CsrA/RsmA dans les tiges-boucles prédites qui entrent en compétition avec les ARNm pour la liaison CsrA2 et CsrA3, s'opposant ainsi à la suppression de la traduction.

RsmA (répresseur de métabolites secondaires)36 et son homologue CsrA (régulateur de stockage de carbone A)37 sont des protéines de liaison à l'ARN qui interagissent avec le motif GGA non traduit en 5' des ARNm près du site de liaison aux ribosomes (RBS) des gènes cibles, bloquant ainsi accès aux ribosomes38. Les protéines CsrA/RsmA peuvent être séquestrées par des ARN régulateurs, ce qui soulage la répression traductionnelle des ARNm cibles39. Nous avons cherché à savoir si CsrA/RsmA contribuait à la synthèse de pseudoiodinine chez P. mosselii 923. Des algorithmes BLAST ont été utilisés pour rechercher des orthologues CsrA/RsmA dans le génome de P. mosselii 923, et trois gènes homologues ont été identifiés, à savoir csrA1, csrA2 et csrA3. CsrA2 et CsrA3 ont montré plus de 75% de similitude d'acides aminés, tandis que CsrA1 était similaire à moins de 50% (Fig. 19d supplémentaire).

La mutagenèse par délétion et une fusion transcriptionnelle psdA::uidA ont été utilisées pour déterminer si CsrA1, CsrA2 et CsrA3 étaient impliqués dans l'expression de psdA. Nous avons analysé l'expression de csrA1, csrA2 et csrA3 dans le type sauvage 923 et dans les mutants ΔcsrA1, ΔcsrA2 et ΔcsrA3 en mesurant l'activité du promoteur psdA. Les tests GUS quantitatifs ont montré que l'activité GUS induite par le promoteur psdA était considérablement plus élevée chez les mutants ΔcsrA1, ΔcsrA2 et ΔcsrA3 que dans la souche de type sauvage 923 (Fig. 19f supplémentaire). Ces résultats ont indiqué que la suppression de csrA1, csrA2 et csrA3 augmentait l'expression de psdA, ce qui suggère que les protéines CsrA répriment la transcription de l'opéron de biosynthèse de pseudoiodinine. Pour étudier plus avant si CsrA1, CsrA2 et CsrA3 étaient nécessaires pour améliorer la production de pseudoiodinine, des mutants de suppression supplémentaires ont été construits, à savoir ΔcsrA1A2, ΔcsrA1A3, ΔcsrA2A3 et ΔcsrA1A2A3. La production de pseudoiodinine a été significativement améliorée chez les mutants ΔcsrA2, ΔcsrA3, ΔcsrA1A2, ΔcsrA1A3, ΔcsrA2A3 et ΔcsrA1A2A3 mais pas la souche mutante ΔcsrA1 (Fig. 5d, e), ce qui était cohérent avec les tests antibactériens contre Xoo PXO99A ( Fig. 19e supplémentaire). Ces résultats indiquent que CsrA1, CsrA2 et CsrA3 ont un impact négatif sur l'expression de psdA et la production de pseudoiodinine, et que CsrA2 et CsrA3 fonctionnent comme des régulateurs majeurs (Fig. 5e, f).

L'opéron psdABCDEFG a été utilisé pour construire la souche génétiquement modifiée P. mosselii ΔcsrA1A2A3-pBSPPc-P2064-RBS-Pseu-ORF, qui a été optimisée pour une production plus élevée de pseudoiodinine basée sur le système de régulation GacA-rsmY/Z-CsrA123. La culture de P. mosselii 923 dans un bouillon de soja tryptique (TSB) a entraîné une croissance accrue et des niveaux significativement plus élevés de pseudoiodinine après une fermentation de 36 h par rapport au milieu LB (Fig. 20a, b supplémentaires); ainsi, le milieu TSB a été choisi pour d'autres expériences. Ensuite, les gènes csrA1, csrA2 et csrA3 ont été supprimés dans la souche 923, conduisant à 12, 5 mg / L de pseudoiodinine contre 1, 9 mg / L produits par la souche de type sauvage 923 (Fig. 5e). L'opéron psdABCDEFG a ensuite été introduit dans le mutant ΔcsrA1A2A3 pour obtenir la souche ΔcsrA1A2A3-pBSPPc-ABCDEFG (Données supplémentaires 1), ce qui a entraîné une augmentation de 16, 6 fois de la production de pseudoiodinine par rapport à la souche 923 (Fig. 5e). Étant donné que la séquence RBS du gène uidA40 pouvait être liée et régulée négativement par RsmA14, nous avons mesuré l'activité GUS aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel chez le 923 de type sauvage et le mutant ΔcsrA1A2A3. Les tests quantitatifs ont montré que l'activité GUS au niveau transcriptionnel était considérablement plus élevée que le niveau post-transcriptionnel (Fig. 20c supplémentaire); cela indique que la liaison des ribosomes à uidA était supérieure à la liaison à psdA. Par conséquent, le RBS de l'opéron a été modifié pour être régulé négativement par CsrA1, CsrA2 et CsrA3 par la technologie de clonage en une étape (Fig. 20d supplémentaire). Enfin, le rendement en pseudoiodinine par la souche modifiée a été augmenté à 42, 5 mg / L, ce qui était 22, 4 fois plus élevé que le P. mosselii 923 de type sauvage (1, 9 mg / L) (Fig. 5e). Pendant ce temps, nous avons comparé l'activité antibactérienne et la croissance des souches WT et surproductrices, et les résultats ont indiqué que la surproduction de pseudoiodinine améliorait l'activité antibactérienne contre les agents pathogènes Xoo PXO99A et Xoc RS105 (Fig. 21a – c supplémentaires).; cependant, il y a eu une diminution de la croissance de P. mosselii au cours des 14 premières heures de fermentation (Fig. 21d – f supplémentaires).

Les micro-organismes bénéfiques sont abondants dans les agroécosystèmes et fonctionnent pour contrôler les maladies des plantes et favoriser la croissance des plantes26. La découverte de micro-organismes de lutte biologique et le développement de biopesticides naturels constituent un moyen efficace de contrôler les maladies des plantes et de maintenir la sécurité agricole mondiale. Dans cette étude, nous rapportons un BCA potentiel de P. mosselii 923 avec une activité antagoniste spécifique pour Xoo, Xoc et M. oryzae. La pseudoiodinine est le principal composé antagoniste produit par P. mosselii 923, et l'opéron psdABCDEFG est suffisant pour sa production.

Les agents de lutte biologique produits par Pseudomonas spp. ont été utilisés pour lutter contre les maladies agricoles, notamment les phénazines, les antibiotiques lipopeptidiques et d'autres métabolites secondaires41. Les dérivés de la phénazine (par exemple, le PCA et la pyocyanine) ont été utilisés pour le contrôle biologique des maladies fongiques et ont été étudiés chez P. fluorescens 2–79, P. chlororaphis PCL1391 et P. aeruginosa 30–8442. P. mosselii est considéré comme un agent pathogène humain opportuniste distribué dans le sol de la rhizosphère qui est connu pour inhiber les agents pathogènes et les insectes43,44. Par exemple, le groupe de gènes c-xtl impliqué dans la biosynthèse de la xantholysine a été découvert chez P. mosselii BS011 et a inhibé le développement de M. oryzae45. Récemment, une souche modifiée de P. mosselii exprimant le gène ripAA a efficacement supprimé le flétrissement bactérien du tabac46. De plus, une nouvelle protéine insecticide de P. mosselii désignée PIP-47Aa a été efficace pour lutter contre la chrysomèle du maïs47. Dans la présente étude, nous montrons que le P. mosselii 923 de type sauvage a la capacité d'inhiber Xoo (PXO99A), Xoc (RS105) et M. oryzae (R01-1) (Fig. 1a, b). Le composé antimicrobien pseudoiodinine produit par P. mosselii 923 peut inhiber à la fois Xoo (PXO99A) et Xoc (RS105) avec des valeurs EC50 de 0,17 μg/mL et 1,36 μg/mL, respectivement (tableau 1). La pseudoiodinine présente également une forte activité fongicide contre M. oryzae avec une EC50 de 4,43 μg/mL (Fig. 9c supplémentaire). À notre connaissance, il s'agit du premier rapport décrivant P. mosselii 923 et la pseudoiodinine comme antimicrobiens pour la croissance bactérienne et fongique.

Il y a quarante ans, le composé antimicrobien pseudoiodinine a été identifié comme un produit de P. fluorescens var. pseudoiodine22. La pseudoiodinine fait partie de la famille pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazine des NP19. Bien que la synthèse chimique de la pseudoiodinine ait été rapportée19, le rendement est généralement faible et les coûts sont élevés, limitant ainsi la faisabilité d'une source synthétique. Fait intéressant, la base génétique de la biosynthèse de la pseudoiodinine et de l'assemblage de la molécule n'a pas été bien étudiée. Dans cette étude, il a été démontré que GacA régulait positivement la biosynthèse de la pseudoiodinine (Fig. 3a et Fig. 13a – c supplémentaires). Des études antérieures ont montré que le GacS/GacA TCS conservé régule positivement l'expression de plusieurs voies antimicrobiennes chez Pseudomonas, y compris des grappes de gènes chez P. fluorescens48, P. chlororaphis49 et P. aureofaciens50. Dans la présente étude, le mutant ΔgacA était altéré dans la production de pseudoiodinine chez P. mosselii 923 (Fig. 13b, c supplémentaires), ce qui nous a conduit à approfondir la biosynthèse et la régulation de la pseudoiodinine.

Pour identifier le BGC impliqué dans la biosynthèse de la pseudoiodinine, nous avons analysé le génome et le transcriptome de P. mosselii dans la souche 923 et le mutant ΔgacA et avons constaté que les gènes codant pour la GTP cyclohydrolase et la méthyltransférase étaient significativement réprimés dans le mutant ΔgacA (tableau supplémentaire 2). Des mutations ont été générées dans un certain nombre de gènes régulés à la baisse et criblées pour la biosynthèse de la pseudoiodinine et l'activité antibactérienne ; cela a abouti à l'identification de l'opéron psdABCDEFG (Fig. 3e). psdA et psdF codent pour les méthyltransférases, psdB code pour un membre de la superfamille des dioxygénases de la protéine de résistance à la bléomycine glyoxylase, psdC code pour un facteur de modification de la sulfatase, psdD code pour une GTP cyclohydrolase et psdE code pour une protéine répétée WD-40. La suppression de ces six gènes psd a considérablement aboli la production de pseudoiodinine et la complémentation a restauré la production (Fig. 3c, d), indiquant ainsi que psdABCDEF est nécessaire à la biosynthèse de la pseudoiodinine. Le mutant ΔpsdG n'a été que partiellement atténué en termes d'activité antibactérienne et de production de pseudoiodinine (Fig. 3b, c). L'analyse de la séquence de psdG indique qu'il code pour une protéine RibD, qui fonctionne dans la biosynthèse de la riboflavine. Il est bien établi que la riboflavine (vitamine B2) agit comme un cofacteur et une molécule de signalisation51, et le psdG peut jouer un rôle dans la stabilité structurelle ou fonctionnelle de la pseudoiodinine. La pseudoiodinine a été produite dans P. putida KT2440 lorsque l'opéron psdABCDEFG était exprimé en trans (Fig. 4a), ce qui confirme que l'opéron psdABCDEFG est suffisant pour la biosynthèse de la pseudoiodinine chez Pseudomonas.

Les séquences d'acides aminés prédites de PsdD et PsdG montrent une similitude significative avec les gènes codant pour la biosynthèse de la toxoflavine, ce qui suggère que la pseudoiodinine pourrait être partiellement synthétisée via une voie de biosynthèse partagée avec ou similaire à la toxoflavine33. Nous proposons que cette réaction produise de la pseudoiodinine par une séquence d'étapes de contraction du cycle et de méthylation (Fig. 4b). Le 1,6-DDMT est confirmé en tant qu'intermédiaire biosynthétique de la pseudoiodinine lorsque les souches mutantes ΔpsdC ou ΔpsdE en ont été nourries et que la production de pseudoiodinine a été restaurée (Fig. 18 supplémentaire). Cependant, le 1,6-DDMT n'a été détecté ni dans les souches sauvages de P. mosselii 923 ni dans les souches mutantes, que nous pensions qu'il se transformait rapidement en l'intermédiaire suivant. Il convient de souligner que la formation de 1,6-DDMT médiée par PsdE et PsdC reste incertaine et une voie détaillée de contraction de l'anneau vers la pseudoiodinine attend une enquête plus approfondie.

Des études antérieures ont démontré que GacA et CsrA/RsmA ont des rôles régulateurs opposés sur les gènes cibles au niveau post-transcriptionnel52,53. Nos résultats EMSA ont démontré que GacA se lie aux régions promotrices de deux petits ARN non codants, rsmY et rsmZ (Fig. 19b, c supplémentaires), et la liaison a activé la transcription du groupe de gènes synthétiques de la pseudoiodinine. D'autres études bioinformatiques ont indiqué que P. mosselii 923 contenait trois gènes csrA homologues, à savoir csrA1, csrA2 et csrA3 (Fig. 19d supplémentaire). La mutagenèse par délétion et les fusions uidA post-transcriptionnelles ont été utilisées pour montrer que CsrA1, CsrA2 et CsrA3 régulaient négativement l'expression de psdA et la production de pseudoiodinine (Fig. 5d, e et Supplémentaire Fig. 19e, f). Fait intéressant, un site GGA était présent dans la région 5 'non traduite du RBS psdA, ce qui suggérait que CsrA pourrait réprimer l'expression de psdA en se liant au transcrit leader et en bloquant l'accès aux ribosomes (Fig. 5f). D'autres expériences sont nécessaires pour déterminer comment CsrA interagit avec l'ARNm cible. Cependant, le mécanisme par lequel la pseudoiodinine exerce son activité antimicrobienne n'a pas encore été découvert, ce qui justifie une étude plus approfondie. Ce rapport identifie en outre GacA et CsrA comme des régulateurs importants de la biosynthèse de la pseudoiodinine et élargit notre compréhension de la pseudoiodinine en tant qu'antimicrobien pour les bactéries et les champignons.

Les micro-organismes sont la source de nombreux métabolites secondaires bioactifs, notamment des antibiotiques, des composés antitumoraux et antiviraux qui peuvent être utilisés en agriculture et en médecine54. Cependant, les souches de type sauvage isolées de la nature produisent généralement des quantités limitées de métabolites secondaires, ce qui nécessite des stratégies pour améliorer le rendement en métabolites55. Dans la présente étude, nous avons utilisé une approche à plusieurs volets pour améliorer le rendement de la pseudoiodinine, y compris l'ingénierie d'une souche surexprimante, la suppression des gènes régulateurs négatifs, la modification du RBS et l'optimisation du milieu de culture. Ces approches ont conduit au développement d'une souche génétiquement modifiée qui produisait 22, 4 fois plus de pseudoiodinine que le type sauvage avec des rendements moyens de 42, 5 mg / L (Fig. 5e). D'autres méthodes pour augmenter la productivité de la pseudoiodinine sont nécessaires, y compris la fermentation à l'échelle industrielle. D'autres stratégies pour maximiser les rendements de produits comprennent la manipulation de promoteurs, la génomique, l'ingénierie des protéines, la métabolomique et le profilage des métabolites56,57, qui ont été utilisées pour augmenter les rendements de PCA par la souche PA120157 de P. aeruginosa.

Les pesticides sont largement utilisés non seulement en Chine mais aussi dans le monde pour gérer les maladies des plantes. Par exemple, la Shenqinmycine (PCA) a été utilisée pour protéger les cultures de riz et de légumes contre la brûlure de la gaine du riz, la brûlure du poivre et la fonte des semis58. Notre étude a montré que la pseudoiodinine peut prévenir la BLB, la BLS et la pyriculariose causée par les agents pathogènes Xoo, Xoc et M. oryzae sans affecter négativement le riz en serre (Figs. 10–12 supplémentaires) ; nos essais sur le terrain montrent que la pseudoiodinine peut réduire de manière significative les zones de lésion de la BLB avec une efficacité de contrôle biologique de plus de 50% à des concentrations> 5 μM (Fig. 3b, c supplémentaires).

Lors du processus d'analyse d'autres pseudomonades pour le groupe de gènes psdABCDEFG, nous avons constaté qu'il était conservé; cependant, il n'y a pas d'homologues de l'opéron psd chez P. fluorescens. en particulier, la souche type P. mosselii DSM17497 abritait un groupe de gènes de 6931 pb (orf2184, orf2185, orf2186, orf2187, orf2188, orf2189, orf2190) avec une similitude d'acides aminés de 99 % avec l'opéron pseudoiodinine. Plusieurs différences ont été notées dans les groupes de gènes P. mosselii 923 et DSM17497 comme suit : (i) l'acide aminé en position 39 dans Orf2185 est muté de Lys (K) à Asn (N) dans DSM17497 (Fig. 16a supplémentaire) ; (ii) le résidu en position 89 dans Orf2186 est muté de Thr (T) à Ala (A) (Fig. 16b supplémentaire); et les résidus aux positions 158 et 208 dans Orf2190 sont mutés de Tyr (Y) en His (H) et Ser (S) en Val (V) (Fig. 16c supplémentaire), respectivement.

Fait intéressant, P. mosselii DSM17497 n'a pas produit de niveaux détectables de pseudoiodinine et n'a pas inhibé Xoo PXO99A. Pour déterminer si le cluster P. mosselii DSM17497 psd était fonctionnel, nous avons généré deux souches répliquées chacune des mutants P. mosselii 923 ΔpsdB, ΔpsdC et ΔpsdG contenant une copie introduite de l'opéron DSM17497 psd. De manière surprenante, l'activité bactériostatique et la production de pseudoiodinine ont été restaurées au niveau de 923 de type sauvage dans les souches complémentées (Fig. 17a, b supplémentaires). De plus, orf2184-orf2190 ont été exprimés dans P. mosselii DSM17497 (Fig. 17c supplémentaire), indiquant que le groupe de gènes pseudoiodinine a été transcrit dans P. mosselii DSM17497. Il reste possible que des inhibiteurs ou des répresseurs puissent exister dans DSM17497 qui suppriment la synthèse ou l'exportation de pseudoiodinine ou de ses précurseurs. L'absence de production de pseudoiodinine par P. mosselii DSM17497 justifie une enquête plus approfondie, ce qui, espérons-le, améliorera l'efficacité de Pseudomonas en tant qu'agent de lutte biologique.

En résumé, notre étude décrit P. mosselii 923 comme agent de lutte biologique et la pseudoiodinine comme biopesticide vert potentiel. Le BGC pseudoiodinine et la voie de biosynthèse prévue peuvent encourager d'autres études sur l'ingénierie des voies et la production à grande échelle. De plus, le réseau de régulation sous-jacent GacA-rsmY/Z-CsrA123 peut être déployé pour concevoir des rendements plus élevés de pseudoiodinine (Fig. 5f). Cela est urgent car les maladies causées par X. oryzae et M. oryzae continuent de limiter les rendements du riz et nécessitent des méthodes d'intervention vigilantes.

Phytopathogène Xanthomonas spp. ont été cultivées dans de la gélose nutritive (NA) à 28 °C59, et les souches d'E. coli DH5α et BL21(DE3) ont été cultivées dans du milieu Luria Bertani (LB)60 à 37 °C. Un bouillon de soja trypsique (TSB; 30 g/L) a été utilisé pour la culture de souches de Pseudomonas à 30 °C. Le champignon M. oryzae R01-1 a été cultivé dans un milieu de farine d'avoine (OAM)61 à 25 ˚C. Les souches, plasmides et amorces utilisés dans cette étude sont répertoriés dans les données supplémentaires 1 et 2. Au besoin, des antibiotiques ont été ajoutés aux concentrations finales suivantes (µg mL-1) : kanamycine (Km), 25 ; rifampicine (Rif), 75 ; gentamicine (Gm), 20; et spectinomycine (Sp), 25. Des réactifs chimiques comprenant de l'éther de pétrole, de l'acétate d'éthyle, de l'alcool n-butylique et du méthanol ont été achetés auprès de Macklin (Shanghai, Chine). L'acide phénazine-1-carboxylique (PCA) a été fourni par le Dr Yawen He (École des sciences de la vie et de la biotechnologie, Université Shang Hai Jiao Tong). Les enzymes de restriction ont été achetées auprès de Takara Bio (Europe AB).

Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker Avance III 600 MHz (Allemagne). Les échantillons ont été dissous dans du méthanol deutéré (CD3OD) ou du chloroforme deutéré (CDCl3). L'analyse ESI-MS des composés a été réalisée sur un Agilent UPLC 1290 Infinity II/6545 Q-TOF (USA). La HPLC semi-préparative et la HPLC analytique ont été réalisées avec une HPLC Agilent Technologies 1260 Infinity II avec un détecteur DAD. Les colonnes étaient les suivantes : colonne Fisher Wharton C18 (250 × 10 mm, 5 μm, USA) (pour HPLC semi-préparative) et colonne Agilent C18 (150 × 4,6 mm 5 μm, USA) (pour HPLC analytique). Le 1,6-DDMT a été acheté auprès de Princeton Biomolecular Research (n° de catalogue PBMR 232664).

Pour isoler les bactéries à activité antimicrobienne pour Xoc RS105, des échantillons de sol (n = 248) ont été prélevés dans la rhizosphère5. En bref, 10 g d'échantillon ont été mélangés uniformément avec 90 ml d'eau stérilisée, puis cette suspension a été diluée à différents gradients avec de l'eau stérilisée. 100 μL de la solution ci-dessus ont été étalés sur un milieu NA contenant du RS105. L'antagonisme des bactéries du sol envers Xoc, Xoo et d'autres agents pathogènes a été évalué par la méthode Kirby-Bauer (KB)62. Toutes les souches ont été testées en triple et les zones d'inhibition vis-à-vis des bactéries pathogènes ont été mesurées 2 à 3 jours après culture à 28 °C sur NA et M. oryzae R01-1 ont été mesurées 5 jours après culture à 25 °C sur OAM.

L'ARNr 16S de la souche 923 a été amplifié à l'aide des amorces universelles 27F et 1492R (Données supplémentaires 2) en utilisant des méthodes établies5. Le gène complet a été purifié et séquencé par BioSune Biotech (Shanghai, Chine) et utilisé pour les recherches Blast dans la base de données du National Center for Biotechnology Information (NCBI). Les séquences d'ARNr 16S pour 14 Pseudomonas spp. ont été obtenus à partir de la base de données NCBI, et un arbre phylogénétique basé sur l'ARNr 16 S a été construit à l'aide d'analyses de jonction de voisins avec MEGA 7.063. Un test bootstrap avec 1000 répétitions a été utilisé pour évaluer le niveau de confiance, et les entre-nœuds des branches représentaient un pourcentage de confiance > 50 %. Le génome entier de 923 a été séquencé à l'aide de la plateforme de séquençage Illumina Miseq PacBio de Personalbio (Shanghai, Chine). Les valeurs moyennes d'identité nucléotidique (ANI) ont été calculées à l'aide du service en ligne J Species WS64. Pour déterminer la position phylogénétique précise de la souche 923, toutes les séquences du génome de Pseudomonas accessibles au public et les souches apparentées ont été extraites de la base de données NCBI GenBank et incluses dans les analyses phylogénétiques selon le Type Genome Server (TYGS) (https://tygs.dsmz. dé). La séquence du génome entier de la souche 923 a été déposée dans la base de données NCBI BioProject (BioProject ID : PRJNA826312).

La souche 923 a été cultivée dans 50 ml de bouillon LB à 30 ° C avec une aération à 220 tr / min pendant 12 h, puis diluée au 1: 100 dans des flacons de 2 L contenant 300 ml de bouillon LB et incubée pendant 24 h à 30 ° C, 220 tr / min. La fermentation a été extraite trois fois avec un volume égal d'éther de pétrole, d'acétate d'éthyle et d'alcool n-butylique à température ambiante, respectivement. Les phases organique et aqueuse ont été concentrées avec un évaporateur rotatif, lyophilisées et remises en suspension dans 1 ml de méthanol et d'eau stérile, respectivement. Cinquante microlitres des quatre échantillons ci-dessus ont été prélevés et évalués pour l'activité antibactérienne en utilisant Xoo PX099A comme décrit précédemment5.

L'extrait d'acétate d'éthyle a présenté la plus grande activité antagoniste contre Xoo PX099A. Une fermentation à grande échelle a été effectuée et un lot de 10 L de la fermentation a été extrait davantage par de l'acétate d'éthyle. L'extrait brut gélatineux a ensuite été chargé sur une colonne de gel de silice en phase inverse C18 (MeOH/H2O, 3:7 à 9:1). Douze fractions ont été obtenues à partir de la colonne et purifiées davantage par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) avec une colonne C18 (colonne Agilent C18, 250 × 20 mm, 5 μm, USA) (méthode A). En utilisant cette approche, sept composés ont été isolés et désignés PM-1, PM-2, PM-3, PM-4, PM-5, PM-6 et PM-7. L'activité antagoniste de chaque composé a été testée contre PX099A après concentration avec du méthanol comme témoin.

Méthode de préparation et d'analyse HPLC : Méthode A (préparation) : La concentration initiale de 15 % de méthanol a été maintenue pendant 2 min et les gradients d'élution se sont déroulés comme suit : gradient linéaire de méthanol de 15 à 100 %, 2 à 18 min ; 100 % méthanol, 18–22 min ; 100 à 15 % de méthanol, 22 à 26 min ; et 15 % de méthanol, 26 à 30 min. Le débit était de 5 mL/min avec un détecteur UV (longueur d'onde : 210 et 500 nm). Méthode B (analyse) : HPLC utilisant les solvants A (eau) et B (méthanol) avec un débit de 0,4 mL/min (Colonne Agilent C18, 150 × 4,6 mm 5 μm, USA, 210 et 500 nm). La concentration initiale de 5 % de méthanol a été maintenue pendant 4 min, suivie des gradients suivants : 5 à 20 % de méthanol, 4-25 min ; 20 à 100 % de méthanol, 25 à 26 min ; 100 % de méthanol, 26 à 32 min, 100 à 5 % de méthanol, 32 à 33 min et 5 % de méthanol, 33 à 40 min.

La formule moléculaire de PM-3 a été déterminée comme étant C6H7N5O par UPLC/Q-TOF-MS (m/z 166,0722 [M + H]+, calculé pour C6H8N5O, 166,0729) avec six IHD (indice de carence en hydrogène). Les données RMN 1H et 13C (Figs. 5, 6 supplémentaires) ont montré la présence de deux groupes méthyle (δH 4,27, 4,44 ; δC 43,3, 57,7) et d'un proton aromatique (δH 9,14). Parce qu'il y a trop d'atomes de carbone et d'azote quaternaires dans la molécule, il était difficile de déterminer davantage la structure plane des PM-3. Heureusement, un minuscule cristal a été généré dans le solvant méthanol par évaporation du solvant après de nombreuses tentatives. Enfin, la structure complète de PM-3 a été déterminée par diffraction des rayons X (Fig. 2c) et elle était identique à la pseudoiodinine.

Des cultures de graines (500 μL) ont été inoculées dans 50 mL de LB ou de TSB dans des flacons de 250 mL. Afin d'extraire et de quantifier la pseudoiodinine, 1 ml de culture a été collecté et extrait deux fois avec des volumes égaux d'acétate d'éthyle. La phase organique a ensuite été récupérée et séchée à 30°C. et le résidu résultant a été dissous dans 100 μL de méthanol. Des extraits bruts (5 μL) ont été collectés pour analyse HPLC (Méthode B). La production de pseudoiodinine a été quantifiée en utilisant la surface du pic (A) dans l'éluat HPLC selon la formule suivante : A = 776,86 pseudoiodinine (mM) + 52,234. La formule a été dérivée d'une courbe d'étalonnage avec de la pseudoiodinine purifiée, qui avait un coefficient de corrélation (R2) de 0,999. L'expérience a été répétée trois fois indépendamment.

Les souches de P. mosselii ont été cultivées dans 3 ml de LB à 30 ° C, 220 tr/min pendant 12 h. Les cellules récoltées ont été mises en suspension à une concentration finale de DO6oo = 2,0 en utilisant du milieu TSB. Des dilutions en série ont été préparées et des aliquotes de 100 μL ont été incubées sur du milieu LB additionné des antibiotiques appropriés à 30 ° C pendant la nuit. Pour la courbe de croissance, 10 ml de cultures de fermentation dans des flacons de 50 ml contenant du TSB ont été préparés comme décrit ci-dessus et incubés à 30 ° C à 220 tr/min. La croissance des cultures a été suivie par des mesures périodiques dans les 36 h par spectrophotométrie à 600 nm (OD600). Cette expérience a été répétée trois fois indépendamment.

Vingt graines du cultivar de riz Yuanfengzao ont été semées dans des pots en plastique (16 × 12 cm), qui ont été maintenus dans la serre à 14 h de lumière (30 °C)/10 h d'obscurité (28 °C) et 65 % d'humidité relative. Des semis de riz ont été utilisés pour des essais de lutte biologique après 21 jours de culture (stade 3–6 feuilles). Les plants de riz au stade trois feuilles conviennent aux essais de lutte biologique Xoo et Xoc. Les plants de riz au stade six feuilles conviennent aux inoculations par pulvérisation Xoo et Xoc en serre. Des suspensions cellulaires de Xoc RS105 et Xoo PXO99A (OD600 = 0,6) et P. mosselii 923 (OD600 = 0,5) ont été préparées à l'avance. En bref, ces souches ont été cultivées jusqu'à la phase mi-exponentielle, centrifugées et lavées deux fois avec de l'eau distillée stérile jusqu'à une DO600 de 0,5 à 0,6. Le surnageant de la culture 923 (SUP) a été préparé par centrifugation à 4 °C, 13 800 × g pendant 10 min. Des solutions mères de pseudoiodinine avec des valeurs de CMI de 4 µg/mL pour Xoc RS105 et 0,5 µg/mL pour PXO99A ont été préparées. De l'eau distillée stérile (MOCK) a été utilisée comme témoin.

Des essais de lutte biologique sur des plantules de riz au stade trois feuilles ont été inoculés par injection à la seringue. Brièvement, des feuilles de riz Yuanfengzao ont été inoculées avec Xoc RS105-Gus (OD600 = 0,6) à 3 h avant (Tre) et après (Pré) inoculation avec de l'eau, 923, ΔpsdA (OD600 = 0,5) ou 923 SUP par seringue sans aiguille, puis maintenues dans la serre. Les longueurs des lésions pathologiques ont été mesurées à 7 jours. Des plants de riz Yuanfengzao au stade de six feuilles ont été pulvérisés avec des suspensions de cellules bactériennes (2 mL de 1,0 × 108 cfu mL−1). Les traitements étaient les suivants : (1) plants de riz inoculés avec les souches RS105 ou PXO99A ; (2) riz inoculé avec les agents pathogènes RS105 ou PXO99A puis traité avec de l'eau, la souche 923 (suspension de 2 ml) ou de la pseudoiodinine (5 ml) comme traitements au Tre ; (3) riz inoculé avec de l'eau, souche 923 (2 ml) ou pseudoiodinine (5 ml) 12 h avant l'inoculation par pulvérisation avec RS105 ou PXO99A comme prétraitements ; et (4) contrôles inoculés à l'eau distillée stérile (MOCK). 0,05 % (v:v) de Tween-20 (Sangon Biotech, Cat. No. A600560) a été utilisé dans chaque traitement. Les zones de lésions de la maladie ont été mesurées sur les feuilles (n = 20) à 15 jours et la croissance bactérienne a été mesurée à 7, 14 et 21 jours après l'inoculation. En bref, trois morceaux de 4 cm des extrémités des feuilles ont été excisés avec des ciseaux chirurgicaux stériles et traités avec de l'éthanol à 75 % (30 s), de l'hypochlorite de sodium à 3 % (3 min) et de l'eau distillée stérile (1 min). Le matériel foliaire a ensuite été macéré avec un broyeur de tissus (JX-FSTPRP) à 55 Hz (deux fois pendant 1 min) puis maintenu à température ambiante pendant 30 min. Des dilutions en série ont été préparées et incubées sur NA complété avec les antibiotiques appropriés à 28 ° C pendant 3 à 4 jours jusqu'à ce que des colonies uniques puissent être comptées (> 100/plaque). Les expériences d'inoculation ci-dessus ont été répétées trois fois indépendamment.

Pour les essais de lutte biologique au champ, le cultivar de riz Yuanfengzao a été semé dans des rizières (1 × 2 m). Dans l'essai sur le terrain, seules les feuilles étendard des plants de riz ont été choisies pour la mesure dans une méthode d'échantillonnage en cinq points où un point comprend 10 plants de riz et une feuille étendard/par plante. Un total de 50 feuilles ont été évaluées pour chaque traitement. La gravité des maladies BLS et BLB a été étudiée en fonction de la zone de lésion sur les feuilles (n = 15) à 15 jours après l'inoculation. Les expériences sur le terrain ont été répétées trois fois indépendamment.

Riz cv. CO39 (Oryza sativa L. subsp. indica) est très sensible à M. oryzae et a été choisi pour les études d'infection. Des suspensions de conidies ont été produites à une concentration finale de 1 × 105 conidies ml-1 en inondant des plaques de culture de M. oryzae âgées de 10 jours avec de l'eau distillée stérile contenant 0, 05% (v: v) de Tween-20 comme ci-dessus. La suspension a ensuite été inoculée par pulvérisation sur des plantes âgées de 2 semaines. La pseudo-iodinine a été pulvérisée sur la surface des feuilles de riz à une concentration de 40 μM 24 h avant (pré) et après (tre) inoculation avec la spore M. oryzae R01-1. Les plantes ont été placées dans des boîtes de stockage pendant 24 h pour maintenir une humidité élevée avec une photopériode lumière/obscurité de 14 h 10 à 25 °C et 90 % d'humidité relative. La gravité de la maladie a été enregistrée à 7 dpi par imagerie. La surface relative des lésions a été calculée avec Adobe Photoshop CS5. L'expérience a été répétée trois fois indépendamment.

Nos recherches précédentes ont démontré que les systèmes de vecteurs dérivés de pHM1, y compris pHG1, étaient efficaces, stables et adaptés à l'analyse de l'expression génique dans les souches de X. oryzae et au suivi des infections dans les feuilles de riz40. Des recherches antérieures avec des vecteurs pHM1 ont indiqué que l'intensité de la coloration GUS dans les feuilles de riz était corrélée à la multiplication bactérienne ; ainsi, l'activité GUS des souches marquées Xoc RS105-Gus dans les tissus de riz a été dosée selon nos protocoles précédents65. La méthode détaillée a été décrite dans les méthodes supplémentaires. Chaque traitement a été répété sur trois feuilles et trois expériences indépendantes ont été réalisées.

L'activité GUS dans les souches de P. mosselii a été évaluée en utilisant un protocole modifié. En bref, P. mosselii 923 et les mutants ont été cultivés dans du LB contenant de la spectinomycine à 30 ° C pendant la nuit. Les cellules bactériennes ont été recueillies dans des tubes de microcentrifugeuse de 2 ml (trois répétitions), lavées deux fois avec 1 ml d'eau stérile et ajustées à une DO600 de 0,5. Des analyses GUS qualitatives et quantitatives de P. mosselii 923 et des mutants ont été effectuées comme décrit dans les méthodes supplémentaires.

Les sites de clonage multiples (MCS) dans le vecteur sonde promoteur pNG1 étaient positionnés en amont de uidA, et le site NdeI chevauchait le site d'initiation de la traduction (ATG). Ainsi, nous avons créé des fusions promoteur-sonde uidA au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel. La région du promoteur psdA a été clonée dans pNG1 en tant que fragment EcoRI / KpnI pour créer pNG1-P2064 avec la fusion promoteur psdA-uidA (Données supplémentaires 1). En utilisant une approche similaire, le promoteur psdA a été cloné dans pNG1 sous la forme d'un fragment EcoRI/NdeI, résultant en une fusion traductionnelle avec uidA ; la construction résultante a été désignée pNG1-P2064-post (Données supplémentaires 1).

La mutagenèse de la souche 923 de P. mosselii avec EZ-Tn5 et la caractérisation des sites d'insertion ont été réalisées à l'aide de protocoles établis5. En bref, 1 μL de l'EZTn5 du kit EZ-Tn5 ™ Tnp Transposome ™ (Lucigen, TSM08KR) a été électroporé dans une cellule compétente 923, puis a criblé des mutants qui perdaient absolument ou atténuaient partiellement l'activité antagoniste contre Xoo PXO99A. Le clonage récupéré du site d'insertion du transposon EZ-Tn5 dans l'ADN génomique 923 a été donné selon les protocoles du fabricant.

Un mutant de délétion gacA a été généré par double recombinaison homologue médiée par sacB. Les séquences flanquant gacA à 716 pb en amont et 487 pb en aval ont été amplifiées par PCR à l'aide des amorces gacA-up-F1/gacA-up-R1 et gacA-down-F2/gacA-down-R2 (Données supplémentaires 2), respectivement. Les produits amplifiés en amont et en aval ont été purifiés sur gel, digérés avec NdeI/KpnI et XbaI/NdeI, respectivement, et clonés dans p2P24Km66 pour obtenir la construction p24-gacA (Données supplémentaires 1). Après ligation, cette construction a été introduite dans des cellules compétentes E. coli DH5α et cultivée sur LB contenant Km. Les colonies contenant p24-gacA ont été confirmées par PCR avec les amorces M13-F et M13-R (Données supplémentaires 2) et séquencées. Le plasmide p24-gacA a été introduit dans P. mosselii 923 par électroporation, et les colonies résistantes à la kanamycine et sensibles au saccharose ont été sélectionnées successivement sur NAN (NA sans saccharose) contenant Km (NAN + Km) et NAS (NA contenant 10% de saccharose). Les colonies survivantes à NAS ont été cultivées individuellement sur NA et NA + Km, et les colonies qui se sont développées sur NA mais pas sur NA + Km ont été confirmées par PCR avec des amorces dans les données supplémentaires 2. La suppression de gacA a été confirmée par analyse de séquence et vérifiée en testant pour bactériostase et production de pseudoiodinine comme décrit ci-dessus.

Un fragment de 1074 pb contenant gacA et la région promotrice en amont a été amplifié par PCR avec les amorces gacA-com-F et gacA-com-R (Données supplémentaires 2). Le produit de PCR a été cloné dans pUFR034 sous la forme d'un fragment EcoRI/Kpnl pour donner le plasmide recombinant pUFR-gacA ; cette construction a été confirmée par PCR avec des amorces M13, séquencée, puis introduite dans P. mosselii 923 et le mutant ΔgacA par électroporation. Les colonies ont été sélectionnées sur LB contenant Km, identifiées par PCR et confirmées par des tests de bactériostase et de production de pseudoiodinine. Les souches mutantes complémentées et surexprimant gacA ont été désignées CΔgacA et 923 pUFR-gacA, respectivement.

Le type sauvage P. mosselii 923 (WT) et le mutant knock-out ΔgacA (KO) ont été cultivés dans LB pendant 24 h. Trois répliques biologiques ont été préparées pour chaque souche. Les cellules bactériennes (1 mL) ont été collectées et centrifugées pendant 2 min à 9600 × g à 4 °C ; cela a été répété avec une autre aliquote de 1 mL de cellules. Les surnageants ont été retirés, congelés dans de l'azote liquide pendant 15 min et conservés à -80 ° C jusqu'à utilisation.

L'ARN-seq a été réalisé par Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd. avec le système Illumina HiSeq. Le package DEseq R a été utilisé pour analyser les DEG de KO par rapport à WT et une valeur P corrigée (valeur q) <0, 005 et un changement de facteur log2> 1 ont été utilisés pour établir la signification. Des parcelles de volcan ont été créées à l'aide du package ggplots2 en langage R et plot_volcano de soothsayer (https://github.com/jolespin/soothsayer) dans Python v. 3.6.6. Les cartes thermiques ont été produites par le langage R et le progiciel Pheatmap (https://rdrr.io/cran/pheatmap/). Des méthodes de liaison euclidienne et complète ont été utilisées pour calculer la distance et le regroupement, respectivement.

Pour vérifier les données RNA-seq, trois analyses indépendantes de PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) ont été effectuées sur des échantillons WT et KO en utilisant les mêmes traitements que ceux utilisés pour RNA-seq. Quinze DEG ont été sélectionnés au hasard pour une confirmation secondaire par analyse RT-qPCR. L'ARN total des échantillons WT et KO a été extrait à l'aide du kit EasyPure RNA (Transgen Biotech). L'ADNc a été préparé avec le kit Super Mix de synthèse d'ADNc (Transgen Biotech). Les fragments de PCR marqués en vert SYBR ont été amplifiés et la RT-qPCR a été réalisée avec un système de PCR en temps réel ABI7500 (Applied Biosystems, USA). rpoD a été utilisé comme contrôle interne et gène de référence, et la méthode 2−ΔΔCt a été utilisée pour la quantification relative67. Toutes les réactions RT-qPCR ont été effectuées trois fois ou plus indépendamment à l'aide des amorces répertoriées dans les données supplémentaires 2.

La délétion des gènes psd individuels a été accomplie par double recombinaison homologue médiée par sacB comme décrit ci-dessus. Les amorces utilisées pour amplifier les séquences flanquant chaque gène sont répertoriées dans les données supplémentaires 2. Les mutants de suppression ont été identifiés par PCR avec les amorces correspondantes (données supplémentaires 2) et évalués plus en détail pour la bactériostase et la production de pseudoiodinine. Les autres mutants de délétion décrits dans cette étude ont également été générés à l'aide d'une double recombinaison homologue médiée par sacB.

Pour les analyses de complémentation, psdA, psdB, psdC, psdD, psdE, psdF et psdG et le promoteur psdA ont été amplifiés et clonés dans pBSPPc pour obtenir les plasmides pBS-psdA, pBS-psdB, pBS-psdC, pBS-psdD, pBS-psdE , pBS-psdF et pBS-psdG, respectivement. (Données supplémentaires 1). Les constructions ont ensuite été introduites dans les mutants de délétion correspondants et testées pour la complémentation. Les mutants rsmY et rsmZ ont été complémentés par clonage dans pUFR034 selon le même protocole.

Les plasmides pBSPPc-Pseu-ORF et pNG1-P2064 ont été construits comme décrit ci-dessus. Les amorces utilisées sont répertoriées dans les données supplémentaires 2 et ont été synthétisées par Shanghai Generay Biotech Co., Ltd. pBSPPc-Pseu-ORF linéarisé a été obtenu par PCR inverse avec les amorces pBS-Pseu-F2 et pBS-Pseu-R2 et mélangé avec pNG1 linéarisé -P2064 (Fig. 20d supplémentaire) ; la recombinaison s'est déroulée à l'aide des protocoles fournis avec le kit de clonage en une étape ClonExpress II (Vazyme, Nanjing, Chine). Le produit de recombinaison, pBSPPc-P2064-RBS-Pseu-ORF, a été utilisé pour transformer les cellules réceptrices.

L'opéron à sept gènes (psdABCDEFG) a été cloné avec son promoteur natif dans pBSPPc. Le fragment d'ADN de 7,2 kb a été amplifié avec les amorces pBS-Pseu-F et pBS-Pseu-R (Données supplémentaires 2) et purifié à l'aide d'un kit d'extraction sur gel. Le fragment de 7,2 kb a été inséré dans pBSPPc digéré par Xbal/BamHI et cloné en suivant les instructions fournies avec le kit de clonage en une étape ClonExpressII. La construction résultante a été appelée pBSPPc-ABCDEFG ; cela a été introduit dans P. putida KT2440 par électroporation et vérifié par PCR.

La souche de P. putida modifiée a été cultivée dans 20 mL de TSB additionné de 20 μg/mL de gentamicine, et les cellules ont été cultivées à 30 °C, 220 tr/min, pendant 24 h. Le bouillon de fermentation a été centrifugé et le surnageant a été extrait trois fois en utilisant des volumes égaux d'acétate d'éthyle. Les phases organiques combinées ont été concentrées et dissoutes dans du méthanol pour analyse HPLC (Méthode B).

Pour les expériences de surexpression, le plasmide pBSPPc-ABCDEFG (Données supplémentaires 1) contenait l'opéron psdABCDEFG et son promoteur natif a été introduit dans P. mosselii ΔcsrA1A2A3 comme décrit ci-dessus et analysé pour la production de pseudoiodinine.

Le groupe de gènes homologues de la pseudoiodinine (orf2184-2190) de P. mosselii DSM17497 et son promoteur natif a été cloné sous forme de fragment XbaI/BamHI dans pBSPPc, ce qui a donné pBS-DSM17497-Pseu (Données supplémentaires 1). Ce clone a été introduit dans les mutants P. mosselii 923 ∆psdB, ∆psdC et ∆psdG pour déterminer si l'opéron psd DSM17497 pouvait compléter les souches mutantes 923. Deux souches de chaque mutant (PsdB-comp.1 et PsdB-comp.2 ; PsdC-comp.1 et PsdC-comp.2, et PsdG-comp.1 et PsdG-comp.2) ont été générées en introduisant le plasmide pBS- DSM17497-Pseu dans les mutants correspondants par électroporation (Données supplémentaires 1). Les mutants complémentés ont été évalués pour la bactériostase et la production de pseudoiodinine comme décrit ci-dessus.

DSM17497 contient sept gènes homologues à l'opéron pseudoiodinine de P. mosselii 923, à savoir orf2184 (psdA), orf2185 (psdB), orf2186 (psdC), orf2187 (psdD), orf2188 (psdE), orf2189 (psdF) et orf2190 (psdG) . La RT-PCR a été utilisée pour déterminer si les sept gènes putatifs de pseudoiodinine étaient exprimés dans P. mosselii DSM17497. L'ARN total de P. mosselii DSM17497 a été extrait à l'aide du kit EasyPure RNA (Transgen Biotech) et l'ADNc a été préparé avec le kit Super Mix de synthèse d'ADNc (Transgen Biotech). Le gène de l'ARNr 16S a été utilisé pour la normalisation. Les amorces utilisées pour la RT-PCR sont répertoriées dans les données supplémentaires 2 et l'expérience a été répétée trois fois indépendamment.

L'ORF gacA a été amplifié par PCR avec les amorces gacA-F et gacA-R (données supplémentaires 2) et cloné dans pET28a sous la forme d'un fragment NdeI/XhoI. La construction résultante, pET28-gacA, a été transformée dans E. coli BL21 (DE3). Pour la surexpression, une colonie unique E. coli BL21 a été inoculée dans 20 ml de LB avec Km et cultivée pendant la nuit à 37 ° C. Les cellules (5 ml) ont ensuite été transférées dans 500 ml de LB et cultivées à 37 ° C, 220 tr/min jusqu'à OD600 = 0, 6–0, 8; les cellules ont ensuite été induites avec de l'IPTG 0,5 mM et cultivées pendant une nuit à 16 °C. Les culots ont été récoltés par centrifugation à 4 °C, 3 500 × g pendant 10 min, lavés deux fois dans du PBS et mis en suspension dans du tampon A (Tris-HCl 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7,5) contenant une concentration finale de PMSF 1 mM ( fluorure de phénylméthanesulfonyle). Les cellules ont été rompues par sonication et des extraits sans cellules ont été obtenus par centrifugation à 4 ° C, 13 800 × g pendant 30 min. Les surnageants ont été appliqués sur la résine d'agarose His Sep Ni-NTA (Yeasen Biotechnology), qui a été équilibrée avec le tampon A avant utilisation. La colonne Ni-NTA a été lavée trois fois avec du tampon A et la colonne a été éluée avec un gradient d'imidazole de 20 à 250 mM dans le tampon A. Les fractions de 20 à 250 mM ont été regroupées et séparées par SDS-PAGE. La fraction contenant GacA a été concentrée et échangée avec un tampon de stockage (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, glycérol 5 %, pH 7,5). La concentration en protéines a été estimée à l'aide d'un microspectrophotomètre Nano-300 (Hangzhou Allsheng Instruments Co.) et la préparation a été stockée à -80 ° C jusqu'à utilisation.

Des sondes promotrices marquées au Cy5 contenant le motif UAS (TGTAAG-N6-CTTACA) dans rsmY et rsmZ ont été synthétisées commercialement (Shanghai DNA Bioscience Co. Ltd). L'EMSA a été réalisée à l'aide de protocoles établis68. En bref, la His-GacA purifiée a été mélangée avec des fragments de promoteur rsmY et rsmZ marqués au Cy5, respectivement, puis chargée sur un gel de polyacrylamide non dénaturant à 4, 5% pour l'électrophorèse. Le fluorophore Cy5 a été détecté à l'aide d'un Amersham Typhoon RGB Biomolecular Imager (Cytiva, Suède). Les expériences EMSA ont été répétées trois fois indépendamment.

Les CMI de la pseudoiodinine et du PCA pour Xanthomonas spp. ont été déterminées par dilution en série. NA a été préparé contenant de la pseudoiodinine à 0–64 μg/mL ou du PCA à 0–256 μg/mL. Deux microlitres de suspension bactérienne (OD600 = 1,0) ont été dilués trois fois et déposés sur des plaques NA. Après une incubation de 48 h à 28 °C, les CMI ont été définies comme la concentration la plus faible à laquelle aucune croissance n'était visible.

Les valeurs EC50 de la pseudoiodinine et du PCA ont été déterminées en fonction de l'inhibition de la croissance. En bref, 10 μL de suspension bactérienne ont été ajoutés à 5 mL de NB contenant des concentrations diluées de pseudoiodinine et de PCA. Les valeurs OD600 des suspensions testées ont été mesurées lorsque les suspensions témoins ont augmenté jusqu'à OD600 = 1,0. Le log du pourcentage d'inhibition basé sur les valeurs OD600 a été régressé sur le log des concentrations du composé, et les valeurs EC50 ont été calculées. Cette expérience a été réalisée trois fois ou plus indépendamment.

La CE50 de M. oryzae R01-1 a été déterminée in vitro en transférant des bouchons (0,5 cm2 de diamètre) de mycélium d'une colonie fongique en croissance active à une série de plaques OAM contenant de la pseudoiodinine à 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 et 50 µM. Les diamètres des colonies fongiques ont été mesurés après une incubation de cinq jours à 25 ° C dans l'obscurité, et l'inhibition a été calculée en pourcentage de la croissance témoin. Les valeurs EC50 ont été calculées sur la base d'une régression linéaire du diamètre des colonies sur les concentrations de pseudoiodinine transformées en log. Les expériences ont été menées trois fois indépendamment.

La signification statistique a été calculée à l'aide de la méthode de test de la différence la moins significative (LSD) et de l'analyse ANOVA unidirectionnelle pour les comparaisons multiples à l'aide de SPSS v. 22.0. La valeur des tests statistiques est statistiquement significative dans les légendes des figures comme suit : *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001, ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test LSD. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± écart type (SD). Les données statistiques ont été analysées à l'aide de GraphPad Prism version 8.00. Les zones de lésions ont été calculées à partir des feuilles infectées à l'aide d'Adobe Photoshop CS5. Toutes les expériences ont été répétées au moins trois fois indépendamment pour confirmer la reproductibilité.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données qui appuient les conclusions de cette étude sont disponibles dans ce manuscrit et son fichier d'informations supplémentaires. Les données de séquence du génome de Pseudomonas mosselii 923 utilisées dans cette étude ont été déposées dans la base de données NCBI GenBank sous le code d'accession BioProject PRJNA826312 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP095556). Les données du transcriptome ont été déposées dans le NCBI Sequence Read Archive et sont accessibles avec le code PRJNA880759. Les données cristallographiques pour la structure de la pseudoiodinine rapportées dans cet article ont été déposées au Cambridge Crystallographic Data Center, sous le numéro de dépôt CCDC 2175188. Des copies des données peuvent être obtenues gratuitement via www.ccdc.cam.ac.uk. Les souches, les plasmides et les amorces utilisés dans cette étude sont rapportés dans les données supplémentaires 1–2. Les données sources sont fournies avec ce document. Les données sont également disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous sommes reconnaissants au professeur Carol Bender (Oklahoma State University), au professeur Feng Ge (Institut de zoologie, Académie chinoise des sciences) et au professeur Xuewen Gao (Université agricole de Nanjing) pour leur avis critique sur ce projet. Ce travail a été soutenu par des subventions du National Key Research and Development Program of China (2022YFD1400200, 2017YFD0200400), de la National Natural Science Foundation of China (31830072) et du Shanghai Agriculture Applied Technology Development Program of China (2020‐02‐08‐00 ‐08‐F01462).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Ruihuan Yang, Qing Shi.

Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds/School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, Chine

Ruihuan Yang, Yichao Yan, Shengzhang Li, Yuan Fang, Ying Li, Linlin Liu, Longyu Liu, Yongzheng Peng, Jiangbo Fan, Lifang Zou et Gongyou Chen

State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences & Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, Chine

Qing Shi, Tingting Huang, Xiaozheng Wang, Lifang Zou, Shuangjun Lin et Gongyou Chen

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GC et LZ ont supervisé l'étude. RY, YY, Elle. L., YF, YL, Li. L., Lo. L. et YP ont prélevé des échantillons de sol. RY et Elle. L. souches bactériennes isolées. RY et LZ ont effectué des expériences d'inactivation de gènes, complémentaires et biochimiques. Composés identifiés par RY et QS. RY et JF effectuent des tests de biocontrôle. QS, TH et XW ont réalisé des expériences de biosynthèse. RY et QS ont analysé les données et rédigé le manuscrit. TH, Shu. L. et GC ont révisé le manuscrit.

Correspondance à Lifang Zou ou Gongyou Chen.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Yang, R., Shi, Q., Huang, T. et al. La pseudoiodinine pyrazolotriazine naturelle de Pseudomonas mosselii 923 inhibe les pathogènes bactériens et fongiques des plantes. Nat Commun 14, 734 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36433-z

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Reçu : 12 juin 2022

Accepté : 01 février 2023

Publié: 09 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36433-z

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