Un pore

Communications Biology volume 5, Article number: 730 (2022) Citer cet article

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Le maintien de l'équilibre hydrique est un véritable défi pour les amphibiens en milieu terrestre. Nos études précédentes avec le crapaud Bombina maxima ont découvert un complexe βγ-CAT de protéine porogène et de facteur de trèfle, qui est assemblé sous une réglementation stricte en fonction de signaux environnementaux. Nous rapportons ici un rôle inattendu pour βγ-CAT dans le maintien de l'eau des crapauds. La suppression des sécrétions cutanées de crapaud, dans lesquelles βγ-CAT est un composant majeur, a augmenté la mortalité animale sous stress hypertonique. La βγ-CAT était exprimée de manière constitutive dans les organes osmorégulateurs du crapaud, ce qui était inductible sous la variation des conditions osmotiques. La protéine induit et participe à la macropinocytose in vivo et in vitro. Au cours de l'hyperosmose extracellulaire, la βγ-CAT a stimulé la macropinocytose pour faciliter l'importation d'eau et la libération accrue d'exosomes, qui ont simultanément régulé la distribution des aquaporines. Ensemble, ces découvertes ont révélé qu'en plus de l'aquaporine intégrée à la membrane, une protéine porogène sécrétoire peut faciliter le maintien de l'eau du crapaud via l'induction de la macropinocytose et la modulation de l'exocytose, en particulier en réponse au stress osmotique.

Le maintien de l'équilibre hydrique est un défi majeur auquel les amphibiens sont confrontés lors du processus de transition de l'eau vers la terre1,2. Chez ces animaux, la fonction coordonnée des systèmes nerveux, endocrinien et lymphatique et des organes impliqués dans l'équilibre eau-sel et l'osmorégulation (y compris la peau, la vessie et les reins) entraîne une amélioration du stockage et de l'utilisation de l'eau et une réduction de l'évaporation1,3. Les amphibiens sont capables d'absorber l'eau à travers leur peau1,2. De plus, l'eau est réabsorbée à partir du liquide tubulaire dans le rein et de l'urine stockée dans la vessie urinaire (UB)2,3. Les aquaporines (AQP), protéines des canaux hydriques, jouent un rôle clé dans l'absorption/réabsorption transépithéliale de l'eau dans ces organes et dans la régulation du volume cellulaire4,5. Cependant, il a rarement été étudié sur la fonction physiologique des composants protéiques des sécrétions cutanées des amphibiens dans la régulation de l'homéostasie de l'eau tégumentaire.

La macropinocytose est un mécanisme qui médie l'absorption en masse et l'internalisation du liquide extracellulaire et des solutés qu'il contient, produisant des vésicules endocytaires d'un diamètre de 0,2 à 5 μm6,7. La macropinocytose est une voie endocytaire dépendante de l'actine médiée par l'activation des voies de signalisation Ras et phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), qui est induite soit par des agents endogènes tels que des facteurs de croissance, soit par des microbes invasifs6,8. Il a été documenté que ce processus cellulaire fondamental joue divers rôles physiopathologiques dans une gamme de cellules normales et malignes, notamment l'acquisition de nutriments, la croissance cellulaire, le trafic et le renouvellement des composants membranaires, l'entrée d'agents pathogènes, la surveillance immunitaire et la motilité cellulaire6,9, dix. Cependant, les rôles physiologiques de la macropinocytose, une forme très ancienne d'endocytose, restent incomplètement compris11,12.

Les protéines porogènes (PFP) sont généralement des protéines sécrétoires qui existent sous une forme monomérique soluble dans l'eau et s'oligomérisent pour former des pores transmembranaires (canaux)13,14. Les aérolysines sont des PFP bactériens à barillet β produits par les espèces d'Aeromonas13,14. Fait intéressant, de nombreux PFP de la famille des aérolysines (af-PFP abrégés, anciennement appelés protéines de type aérolysine, ALP) hébergeant un domaine d'insertion membranaire d'aérolysine fusionné avec d'autres domaines ont été identifiés chez divers animaux et plantes15,16. Nos études précédentes avec les sécrétions cutanées du crapaud Bombina maxima ont découvert un réseau d'interaction entre les af-PFP et les facteurs en trèfle (TFF)17. BmALP1, un af-PFP du crapaud, peut être régulé de manière réversible entre les formes active et inactive, dans lequel son paralogue BmALP3 est un régulateur négatif dépendant de la tension en oxygène de l'environnement18. Plus précisément, BmALP1 interagit avec BmTFF3 pour former un complexe PFP actif membranaire nommé βγ-CAT19,20, dans lequel BmTFF3 agit comme un chaperon extracellulaire qui stabilise le monomère BmALP1 et délivre ce PFP à ses cibles membranaires appropriées18,21.

Ce complexe PFP sécrétoire βγ-CAT cible les gangliosides et les sulfatides dans les membranes cellulaires dans un modèle de liaison à double récepteur21. Ensuite, la sous-unité BmALP1 est endocytosée et cette PFP s'oligomérise pour former des canaux sur les endolysosomes, modulant le contenu et les propriétés biochimiques de ces organites intracellulaires21,22,23,24,25. Ainsi, βγ-CAT est une protéine de canal d'endolysosome sécrétoire (SELC). Nous avons émis l'hypothèse que ce complexe PFP représente en fait une voie SELC jusqu'alors inconnue, caractérisée par la médiation de l'importation et de l'exportation de matériel cellulaire par des voies endolysosomales17. En fonction des contextes cellulaires et de l'environnement, les βγ-CAT ont été proposés pour favoriser le crapaud dans le sens et l'absorption de matériaux environnementaux (comme les nutriments et les antigènes) et pour faciliter l'exportation de molécules de cargaison importées sous leurs formes intactes et/ou de produits transformés via stimulant la libération de vésicules extracellulaires17. Ainsi, les effets cellulaires de la protéine SELC βγ-CAT pourraient médier l'échange de matériel entre les cellules et les environnements, tout en maintenant la fonction de barrière muqueuse et en remplissant la défense immunitaire17. En conséquence, les rôles de βγ-CAT dans la défense immunitaire ont été documentés pour la première fois22,23,24,25,26.

La peau des amphibiens est un organe majeur responsable de l'acquisition et du maintien de l'eau1,3, et la βγ-CAT est un composant majeur des sécrétions cutanées de B. maxima18. Dans la présente étude, nous avons constaté que l'expression et la localisation de βγ-CAT chez le crapaud B. maxima sont liées aux conditions osmotiques environnementales et que cette protéine est capable de contrer la déshydratation cellulaire sous hyperosmose extracellulaire. βγ-CAT a stimulé et participé à la macropinocytose cellulaire et à la libération d'exosomes, favorisant l'absorption d'eau et de Na+ et régulant la localisation de l'AQP. Collectivement, ces résultats ont révélé qu'un PFP sécrétoire peut entraîner l'acquisition et le maintien de l'eau.

La peau des amphibiens a joué un double rôle dans l'osmorégulation lors de l'adaptation évolutive aux environnements terrestres27. En conséquence, lorsqu'ils sont exposés à une solution de Ringer hypertonique, les crapauds (B. maxima) perdent rapidement du poids, qui est progressivement récupéré lorsque l'animal est ensuite placé dans une solution de Ringer isotonique (Fig. 1a). Cela suggère que le crapaud transporte de l'eau à travers sa peau dans des conditions de stress osmotique. Les sécrétions cutanées jouent un rôle central dans les fonctions physiologiques de la peau des amphibiens2. De plus, la βγ-CAT est un composant protéique majeur des sécrétions cutanées chez le crapaud B. maxima18. On estime que deux sous-unités de βγ-CAT représentent ensemble environ 50% des protéines dans les sécrétions cutanées de B. maxima (Fig. 1a supplémentaire). Nous avons émis l'hypothèse que les sécrétions cutanées de crapaud, en particulier le βγ-CAT, pourraient jouer un rôle actif dans l'équilibre hydrique. Des expériences de stress osmotique ont été menées pour tester les fonctions possibles des sécrétions cutanées contenant du βγ-CAT dans le maintien de l'équilibre hydrique chez le crapaud. Les crapauds B. maxima ont perdu 20 % de leur poids corporel et 50 % des animaux sont morts lorsqu'ils ont été placés dans la solution hypertonique de Ringer pendant 24 heures (Fig. 1b et Fig. 1b supplémentaire). Les sécrétions cutanées des crapauds ont été épuisées par électro-stimulation 30 minutes avant que les crapauds ne soient placés dans différentes solutions osmotiques. Bien qu'aucun décès de crapaud n'ait été enregistré après électro-stimulation dans la solution de Ringer isotonique, une mortalité est survenue dans la solution de Ringer hypertonique (Fig. 1b). Par conséquent, il semble que les sécrétions cutanées soient essentielles pour que le crapaud puisse faire face aux environnements hypertoniques. Pour étudier plus avant l'implication possible de βγ-CAT dans l'équilibre hydrique du crapaud, la qPCR a été utilisée pour détecter l'expression de deux sous-unités βγ-CAT dans la peau, UB et les reins du crapaud B. maxima pendant la déshydratation et la récupération de poids (absorption d'eau après déshydratation). Il a été constaté que l'expression de la sous-unité βγ-CAT α était régulée positivement dans la peau et les reins lors de la récupération de poids via l'absorption d'eau après déshydratation (Fig. 1c et Fig. 1c supplémentaire). En revanche, l'expression de l'ARNm de la sous-unité βγ-CAT β était régulée positivement dans la peau du crapaud lors de la déshydratation ou de l'absorption d'eau (Fig. 1d), mais pas dans le rein (Fig. 1d supplémentaire). Fait intéressant, dans l'UB, les niveaux d'ARNm des deux sous-unités ont augmenté lorsque les crapauds ont été exposés à une solution de Ringer hypertonique et sont revenus au niveau normal lorsque les crapauds ont ensuite été placés dans une solution de Ringer isotonique (Fig. 1e, f). Par conséquent, l'expression de βγ-CAT est associée à des modifications des conditions osmotiques externes.

a Les changements de poids des crapauds ont été mesurés après les avoir placés dans des solutions de Ringer isotoniques, hypertoniques et hypertoniques/isotoniques. Le poids initial des crapauds est de 19 ± 5 g (n = 5). b Les taux de survie des crapauds dans la solution de Ringer isotonique (i) et hypertonique (h) ont été déterminés après 48 heures. Les crapauds ont été placés dans chacune des solutions après 30 minutes avec (+) ou sans (-) électro-stimulation pour éliminer les sécrétions cutanées de crapaud (n = 6). c – f L'expression des sous-unités βγ-CAT dans la peau de crapaud et UB a été analysée par PCR quantitative fluorescente en temps réel (n = 6). Les crapauds ont été placés dans une solution de Ringer isotonique ou hypertonique pendant 3 heures avant le prélèvement des échantillons. Dans le groupe hypertonique/isotonique, les crapauds ont d'abord été placés dans la solution hypertonique pendant 3 heures, puis déplacés vers la solution isotonique pendant 3 heures supplémentaires avant que les échantillons ne soient prélevés. g, h Suite au placement des crapauds dans une solution de Ringer isotonique, hypertonique ou hypertonique/isotonique comme décrit ci-dessus, la localisation et l'expression de βγ-CAT dans la peau de crapaud (g) et les tissus UB (h) ont été analysées par immunohistofluorescence (IHF). Ep épiderme, De derme, Mg glande muqueuse, Gg glande granuleuse, Lu lumen, Te épithélium transitionnel. Barres d'échelle, 200 μm. *P < 0,05 et **P < 0,01 par le test de Gehan-Breslow-Wilcoxon dans l'analyse du taux de survie. ns (P ≥ 0,05) ; *P < 0,05, **P < 0,01 et ***P < 0,001 par test t non apparié dans d'autres expériences. Toutes les données représentent la moyenne ± SD et sont représentatives d'au moins deux expériences indépendantes. Voir également la Fig. 1 supplémentaire.

De plus, nous avons analysé l'expression et la localisation de la protéine βγ-CAT dans les mêmes conditions de traitement par immunohistofluorescence (IHF). La βγ-CAT était principalement concentrée dans l'épiderme et les glandes de la peau, et elle était régulée positivement dans l'épiderme et la membrane basale pendant le stress osmotique (Fig. 1g). βγ-CAT était principalement localisé dans l'épithélium transitionnel de l'UB. L'expression de la protéine βγ-CAT chez le crapaud UB a été régulée à la hausse dans la solution de Ringer hypertonique et à la baisse lorsque le crapaud a ensuite été placé dans la solution de Ringer isotonique (Fig. 1h). Ensemble, ces résultats ont révélé une implication de βγ-CAT dans les réponses du crapaud au stress osmotique.

βγ-CAT est une protéine fonctionnelle vitale du crapaud B. maxima, et son expression constitutive peut être détectée dans divers tissus de crapaud22,23, y compris les sécrétions cutanées et les cellules épithéliales de la peau et de l'UB, ainsi que les cellules rénales et péritonéales. La sécrétion endogène de βγ-CAT dans ces cellules dérivées de crapaud a ensuite été analysée par un test d'hémolyse, une méthode sensible pour détecter la présence de βγ-CAT18,19 biologiquement actif. Tous les milieux de ces cellules de crapaud cultivées ont montré une activité hémolytique puissante, totalement inhibée par les anticorps anti-βγ-CAT, confirmant la présence de βγ-CAT sécrétée (Fig. 2a supplémentaire). De plus, nous avons mesuré la cytotoxicité de βγ-CAT vis-à-vis des cellules de B. maxima. Auparavant, il a été rapporté que la βγ-CAT ne présentait aucune cytotoxicité pour les cellules péritonéales de crapaud à des doses allant jusqu'à 400 nM22. La présente étude a en outre déterminé que la cytotoxicité du βγ-CAT pour la peau et les cellules épithéliales UB et les cellules rénales de B. maxima ne se produisait que lorsque sa concentration atteignait 2 μM (Fig. 2b supplémentaire), un niveau bien supérieur aux concentrations physiologiques (20-100 nM, tel que déterminé dans le péritoine du crapaud)22. En revanche, les cellules de mammifères sont beaucoup plus sensibles au βγ-CAT. Bien que βγ-CAT n'ait montré aucune cytotoxicité pour les cellules MDCK, Caco-2 et T24 à 10 nM, la protéine a provoqué la mort cellulaire lorsque les doses utilisées étaient supérieures à 50–100 nM (Fig. 2c supplémentaire). Ainsi, dans toutes les expériences ultérieures concernant l'addition de βγ-CAT purifiée à des cellules, les dosages protéiques utilisés étaient : cellules épithéliales de peau de crapaud, 100 nM ; Cellules épithéliales UB, 50 nM; cellules péritonéales, 50 nM; MDCK de mammifère, 10 nM; Caco-2, 10 nM; et T24, 5 nM.

Pour explorer davantage le rôle potentiel de βγ-CAT dans le transport de l'eau, nous avons cherché à savoir si la protéine est capable de contrecarrer la déshydratation cellulaire sous hyperosmose extracellulaire. Nous avons confirmé l'action de βγ-CAT sur les cellules épithéliales UB de crapaud, les cellules MDCK, Caco-2 et T24 de mammifère, comme déterminé par la formation d'oligomères βγ-CAT après traitement avec la protéine (Fig. 2a et Supplémentaire Fig. 2d). Des oligomères βγ-CAT ont été détectés dans des cellules épithéliales UB de crapaud sans l'ajout de la protéine, probablement causée par la βγ-CAT sécrétée de manière endogène (Fig. 2a). L'ajout de βγ-CAT purifié a encore augmenté la concentration d'oligomères de la protéine dans les cellules épithéliales UB (Fig. 2a). Ensuite, nous avons analysé les caractéristiques électrophysiologiques des oligomères βγ-CAT sur des patchs extérieurs-extérieurs de cellules HEK293. Les courants macroscopiques induits par βγ-CAT ont été enregistrés et normalisés, ce qui a la caractéristique d'une rectification vers l'intérieur (Fig. 2b). Ceux-ci ont prouvé que βγ-CAT pouvait former des pores transmembranaires (canaux) et médier le flux d'ions après oligomérisation sur la membrane. Nous avons en outre étudié la sélectivité ionique des canaux βγ-CAT par le biais d'expériences de remplacement d'ions. Des solutions asymétriques de NaCl 150:15 mM ont décalé vers la gauche le potentiel d'inversion de 0 mV à −61,2 mV, ce qui est très proche du potentiel d'équilibre théorique de Na+, indiquant que les canaux βγ-CAT sont perméables à Na+ mais pas à Cl− ( figure 2c). Ces résultats ont démontré que les canaux βγ-CAT permettaient l'écoulement de Na+.

a Des cellules de vessie de crapaud et des cellules MDCK ont été traitées avec ou sans βγ-CAT pendant 15 minutes. L'apparition d'oligomères βγ-CAT dans les cellules traitées a été déterminée par Western blot. b Courbes courant-tension normalisées des canaux formés par 100 nM βγ-CAT sur des cellules HEK293. Les courants ont été déclenchés par un protocole de rampe de 500 ms entre -100 mV et +100 mV toutes les 2 secondes à partir d'un potentiel de maintien de 0 mV (n = 3). c Courbes courant-tension normalisées des canaux βγ-CAT dans les solutions indiquées (pipette/bain) (n = 3). Na+ (150:15 mM) représente le Na+ 150 mM dans la pipette et le Na+ 15 mM dans le bain. d Changements de diamètre des cellules MDCK, Caco-2 et T24 dans du PBS isotonique (295 mOsm) ou hypertonique (400 mOsm) en présence ou en l'absence de βγ-CAT, tel que déterminé à l'aide d'un compteur de cellules. Les cellules digérées ont d'abord été mises en suspension dans du PBS pendant 15 minutes avant d'être utilisées dans cette expérience. e, f Changements de diamètre des cellules épithéliales UB de crapaud dans une solution de Ringer isotonique (noir) et hypertonique (vert) en présence de 50 μg mL-1 d'anticorps de lapin (bleu) ou d'anticorps anti-βγ-CAT (magenta). En (f), les cellules ont d'abord été traitées avec 0,3 mM de HgCl2 pendant 10 minutes avant la mesure du diamètre cellulaire avec un compteur de cellules. Dans toutes les expériences présentées sur la figure 2, les doses de βγ-CAT utilisées étaient de 10 nM pour MDCK et Caco-2, 5 nM pour T24 et 50 nM pour les cellules épithéliales UB de crapaud. Les barres représentent la moyenne ± SD des échantillons en triple dans b–e. Les barres représentent la moyenne ± SD de trois répétitions indépendantes en f. ns (P ≥ 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001 par le test t non apparié. Toutes les données sont représentatives d'au moins deux expériences indépendantes. Voir également la Fig. 2 supplémentaire.

Sur cette base, nous avons exploré le rôle potentiel de βγ-CAT lorsque les cellules étaient provoquées par une hyperosmose extracellulaire à l'aide d'une solution hypertonique. Nous avons observé que βγ-CAT favorisait la récupération de volume des cellules MDCK, Caco-2 et T24 dans une solution hypertonique (Fig. 2d), révélant la capacité de la protéine à faciliter l'absorption d'eau dans des conditions hyperosmotiques. Conformément à ces observations, l'épuisement immunitaire du βγ-CAT endogène a encore diminué les diamètres cellulaires des cellules épithéliales UB de crapaud dans la solution hypertonique de Ringer par rapport à celles en l'absence d'anticorps anti-βγ-CAT (Fig. 2e). Il est bien documenté que les AQP peuvent médier le flux cellulaire rapide de l'eau28. Ainsi, il est nécessaire de clarifier si la récupération du volume cellulaire par absorption d'eau médiée par βγ-CAT sous stress osmotique était associée à la fonction AQP. Étant donné que les sites sensibles au mercure des AQP de B. maxima (BmAQP) dans l'UB ont été conservés au cours de l'évolution (Fig. 2e, f supplémentaires), HgCl2 a été utilisé pour inhiber la fonction des BmAQP. Le volume cellulaire est resté inchangé dans la solution de Ringer hypertonique après blocage des BmAQP avec HgCl2. Inversement, la récupération du volume cellulaire des cellules épithéliales UB de crapaud via l'absorption d'eau a été clairement réduite après immunodéplétion de βγ-CAT endogène (Fig. 2f). Pris ensemble, ces résultats ont révélé la capacité de βγ-CAT à favoriser la récupération du volume cellulaire en stimulant l'acquisition d'eau pendant l'hyperosmose extracellulaire et ont indiqué que l'effet était indépendant du débit d'eau via les AQP de la membrane plasmique.

βγ-CAT participe à la régulation du volume cellulaire, suggérant son implication dans le transport de l'eau. Nous avons ensuite analysé le possible mécanisme cellulaire à l'origine de ce phénomène. L'acquisition d'eau peut être rapidement réalisée par les AQP et/ou la macropinocytose12,28,29. Auparavant, la pinocytose améliorée par βγ-CAT dans un modèle de cellules dendritiques murines (DC)24. Dans la présente étude, nous avons soigneusement étudié la capacité de βγ-CAT à stimuler et à participer à la macropinocytose dans divers types de cellules de B. maxima. Premièrement, la microscopie immunoélectronique (IEM) a révélé que la βγ-CAT était localisée dans les pseudopodes cellulaires et les macropinosomes d'un diamètre allant jusqu'à 300 nm formés par macropinocytose dans la peau de crapaud et les tissus UB (Fig. 3a). Le βγ-CAT était également présent dans les espaces intercellulaires des cellules épithéliales (Fig. 3a). Le dextrane de 70 kDa est un marqueur de la macropinocytose, tandis que le jaune Lucifer (LY) peut être utilisé comme marqueur de l'endocytose en phase fluide, y compris la macropinocytose30,31. Dans les cellules épithéliales obtenues à partir de peau de crapaud et d'UB, et dans les cellules rénales ou péritonéales de crapaud, l'immunodéplétion de βγ-CAT endogène par des anticorps anti-βγ-CAT a fortement diminué l'internalisation de LY et FITC-dextran, par rapport aux cellules observées en présence de contrôle IgG de lapin (Fig. 3b, c et Supplémentaire Fig. 3a, b). De manière surprenante, l'IgG de lapin témoin ajoutée de manière exogène peut induire une pinocytose. La présence généralisée de récepteurs IgG (par exemple, FcRn) dans les cellules peut contribuer en partie à l'effet32. En fait, le gène de type FcRn de B. maxima était également présent dans les cellules de crapaud (Fig. 3c supplémentaire). Pour des raisons inconnues, l'IgG de lapin contribue à la pinocytose des cellules de crapaud en tant que protéine exogène. Nous avons constaté que l'IgG de lapin témoin et les anticorps dérivés de lapin anti-βγ-CAT étaient tout aussi puissants pour induire une macropinocytose dans les cellules MDCK (Fig. 3d supplémentaire). Par conséquent, ceux-ci ont démontré que les anticorps anti-βγ-CAT dérivés de lapin peuvent réduire la macropinocytose induite par la βγ-CAT par immunodéplétion de la βγ-CAT endogène. De plus, l'ajout de βγ-CAT aux cellules de la peau de crapaud et de l'UB, et aux cellules MDCK et T24 de mammifères a amélioré l'internalisation de LY et FITC-dextran (Fig. 3d, e et Supplémentaires Fig. 3e, f). Nous avons constaté que βγ-CAT était endocytosé et localisé dans les macropinosomes des cellules MDCK (Fig. 3g supplémentaire). De plus, les concentrations totales de Na + dans les cellules épithéliales de crapaud UB et les cellules MDCK traitées avec βγ-CAT étaient respectivement de 3, 5 et 1, 1 fois supérieures à celles du groupe véhicule (Fig. 3f).

a Localisation ultrastructurale de βγ-CAT dans la peau de crapaud et les tissus UB analysés par IEM. Véhicule (témoin IgG de lapin). Vésicules endocytaires formées par macropinocytose (astérisques noirs), et distribution de βγ-CAT sur les vésicules (flèches rouges) et les espaces intercellulaires (triangles rouges). b, c L'immunodéplétion du βγ-CAT endogène a diminué la macropinocytose. Des cellules épithéliales de peau de crapaud (b) et UB (c) ont été incubées avec 50 μg mL-1 d'anticorps anti-βγ-CAT pour immunodépléter la βγ-CAT endogène pendant 30 min. L'intensité moyenne de fluorescence a été déterminée par cytométrie en flux avec 100 μg mL-1 de dextrane marqué FITC de 70 kDa et Lucifer Yellow (LY) pendant 30 minutes. IgG de lapin (témoin d'anticorps). Véhicule (témoin absent d'anticorps). d, e L'ajout de βγ-CAT purifié a augmenté la macropinocytose. L'intensité de fluorescence moyenne du dextrane marqué LY et FITC dans la peau de crapaud ( d ) et les cellules épithéliales UB ( e ) a été déterminée par cytométrie en flux avec ou sans βγ-CAT supplémentaire de 100 nM ou 50 nM, respectivement. f Pliez les changements de [Na +] dans les cellules épithéliales UB de crapaud (n = 6) et les cellules MDCK (n = 8) avec et sans l'ajout de 50 nM ou 10 nM βγ-CAT pendant 3 heures, respectivement. g, h L'effet des inhibiteurs sur la macropinocytose induite par la βγ-CAT. Des cellules épithéliales de crapaud UB (g) et des cellules MDCK (h) ont été incubées avec et sans EIPA 100 μM ou WORT 20 μM pendant 1 heure. Ensuite, les cellules ont été cultivées avec 100 μg mL-1 dextran marqué FITC avec 50 nM (cellules UB de crapaud) ou 10 nM (cellules MDCK) βγ-CAT pendant 30 minutes. i Rac123 et phosphorylation de Akt et PI3K en réponse à 10 nM βγ-CAT dans des cellules MDCK pendant 15, 30 ou 60 minutes, comme déterminé par Western blot et les bandes ont été semi-quantifiées avec ImageJ. La ligne pointillée noire fait référence au contrôle à blanc et les données représentent la moyenne ± SD des échantillons en triple dans be, g, h. Les données représentent la moyenne ± SD d'au moins trois répétitions indépendantes en f et i. ns (P ≥ 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001 par le test t non apparié. Toutes les données sont représentatives d'au moins deux expériences indépendantes. Voir également la Fig. 3 supplémentaire.

Ensuite, le mécanisme moléculaire de la macropinocytose induite par la βγ-CAT a été étudié à l'aide d'agents pharmacologiques. Le 5-(N-éthyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA, un inhibiteur de l'échangeur Na+/H+) et la wortmannine (WORT, un inhibiteur de PI3K) sont couramment utilisés pour inhiber la macropinocytose33,34. Nous avons constaté que l'EIPA et le WORT réduisaient la macropinocytose induite par la βγ-CAT dans les cellules épithéliales UB de crapaud et les cellules MDCK de mammifères (Fig. 3g, h). De plus, βγ-CAT a stimulé la phosphorylation de Akt et PI3K et l'expression de Rac123 dans les cellules MDCK (Fig. 3i). Pris ensemble, ces résultats ont démontré que le βγ-CAT, un complexe sécrété de manière endogène d'un PFP et d'un TFF, stimule et participe à la macropinocytose dans diverses cellules de B. maxima ainsi que dans diverses cellules de mammifères.

Les AQP et le flux d'ions sont impliqués dans le transport de l'eau et la régulation du volume des cellules UB de crapaud sous stimulation par plusieurs hormones35,36,37. L'internalisation par macropinocytose est non sélective, alors que les cellules épithéliales transitionnelles sont polaires. Par conséquent, nous avons évalué la relation entre la macropinocytose stimulée par βγ-CAT et BmAQP2. Nous avons observé que la localisation de βγ-CAT et de BmAQP2 dans les cellules épithéliales UB de crapaud différait entre les solutions de Ringer isotoniques, hypertoniques et `` hypertoniques / isotoniques '' (hypertoniques suivies d'un retour à isotoniques) (Fig. 4a). Lorsque les crapauds ont été exposés à la solution de Ringer isotonique, βγ-CAT et BmAQP2 étaient situés ensemble et étaient répartis à la fois sur les côtés apical et basal de l'épithélium de transition chez le crapaud UB. Dans la solution de Ringer hypertonique, βγ-CAT et BmAQP2 ont déplacé leur emplacement vers les côtés basaux ou latéraux de l'épithélium de transition UB. En revanche, lorsque les crapauds ont été remis dans la solution de Ringer isotonique à partir de la solution de Ringer hypertonique, βγ-CAT et BmAQP2 ont commencé à migrer vers le côté apical de l'épithélium de transition. Cette observation suggère que la macropinocytose induite par la βγ-CAT est impliquée dans l'internalisation et le transport de BmAQP2 dans l'UB. Dans MDCK, une colocalisation intracellulaire de βγ-CAT et AQP2 a également été observée (Fig. 4b). Ces résultats indiquent que la macropinocytose stimulée par la βγ-CAT joue un rôle dans la régulation des AQP dans diverses conditions osmotiques, révélant un autre aspect de cette protéine dans la modulation du bilan hydrique du crapaud.

a Colocalisation de βγ-CAT et BmAQP2 dans le tissu UB du crapaud B. maxima après que les crapauds ont été placés dans une solution de Ringer isotonique, hypertonique ou hypertonique / isotonique pendant 3 heures, analysée par immunohistofluorescence. Barres d'échelle, 25 μm. b Colocalisation intracellulaire de βγ-CAT et AQP2 dans des cellules MDCK avec ou sans le traitement de 10 nM de βγ-CAT pendant 15 minutes tel que déterminé par immunofluorescence. Barres d'échelle, 30 μm. Toutes les données sont représentatives d'au moins deux expériences indépendantes.

La sécrétion d'exosomes est un aspect important de l'exocytose cellulaire qui peut être considérée comme un moyen de transport sélectif de matériaux entre les cellules et un mode de communication intercellulaire38. Parce que βγ-CAT favorise la macropinocytose, nous avons exploré plus avant le destin cellulaire et le rôle des vésicules contenant βγ-CAT. Le βγ-CAT a été détecté à la fois dans les corps multivésiculaires (MVB) et les vésicules intraluminales (ILV) des cellules épithéliales UB (Fig. 5a). Considérant que 98% des cellules épithéliales UB de crapaud ont survécu à 3 heures de culture in vitro à température ambiante (Fig. 4a supplémentaire), des exosomes sécrétés par ces cellules ont été collectés et observés (Fig. 5b), qui contenaient des marqueurs exosomes typiques CD63, TSG101 et flotilline -1, et le nombre d'exosomes a augmenté lorsque ces cellules ont été traitées avec du βγ-CAT purifié (Fig. 5c). L'analyse de suivi des nanoparticules (NTA) a révélé que l'immunodéplétion du βγ-CAT endogène atténuait la libération d'exosomes des cellules épithéliales UB et des cellules péritonéales de crapaud (Fig. 5d et Fig. 4b supplémentaire), tandis que l'ajout de βγ-CAT augmentait considérablement la libération d'exosomes de ces cellules. (Fig. 5e et Fig. 4c supplémentaire). Aucun de ces traitements n'a modifié le diamètre moyen de l'exosome. Des résultats similaires ont également été obtenus dans des cellules MDCK et T24 de mammifères (Fig. 4d, e supplémentaires). Collectivement, ces résultats ont montré que βγ-CAT favorise la production et la libération d'exosomes dans les cellules de crapaud et de mammifère.

a Localisation ultrastructurale de βγ-CAT dans le tissu UB de crapaud par IEM. βγ-CAT (flèche) a été facilement détecté dans les MVB (astérisque) ou les ILV. Véhicule (témoin IgG de lapin). b Analyse TEM des exosomes du surnageant de cellules épithéliales UB de crapaud cultivées in vitro pendant 3 heures. c Analyse Western blot des molécules de flotilline-1, TSG101 et CD63 dans des exosomes isolés du surnageant de cellules épithéliales UB de crapaud cultivées in vitro pendant 3 heures avec ou sans addition de 50 nM βγ-CAT. d, e Analyse de la concentration et de la taille des particules (30–200 nm) des exosomes de cellules épithéliales UB de crapaud avec et sans 50 μg mL−1 d'anticorps anti-βγ-CAT (d) ou l'ajout de 50 nM βγ-CAT ( e) par NTA. f, g Le pourcentage (f) et l'intensité de fluorescence moyenne (g) des exosomes contenant du dextrane provenant de cellules épithéliales UB de crapaud dans un milieu de culture contenant 1 mg mL-1 dextran marqué FITC par Nanoflow Cytometry avec ou sans l'ajout de 50 nM βγ-CAT. h Analyse Western blot de βγ-CAT et BmAQP2 dans des exosomes de cellules épithéliales UB de crapaud cultivées in vitro pendant 3 heures avec ou sans addition de 50 nM de βγ-CAT. i Détermination IEM de βγ-CAT et BmAQP2 dans les exosomes (astérisque) de cellules épithéliales UB de crapaud. BmAQP2 et βγ-CAT ont été marqués avec des particules d'or colloïdal de 10 nm (flèche) et 5 nm (triangle), respectivement. j, k Pliez les variations des concentrations totales (j) et moyennes (k) de Na + dans les exosomes du même nombre de cellules MDCK avec ou sans βγ-CAT 10 nM pendant 3 heures. l Pliez les variations des concentrations totales de Na + dans les exosomes du même nombre de cellules MDCK sous le milieu hypertonique avec ou sans 10 nM βγ-CAT pendant 3 heures. Les barres représentent la moyenne ± SD des échantillons en triple en d–g. Les données représentent la moyenne ± ET d'au moins trois répétitions indépendantes en j–l. ns (P ≥ 0,05), *P < 0,05 et ****P < 0,0001 par le test t non apparié. Toutes les données sont représentatives d'au moins deux expériences indépendantes. Voir également la Fig. 4 supplémentaire.

Nous avons en outre étudié les propriétés des exosomes stimulés par βγ-CAT. La distribution de taille des exosomes dérivés de cellules épithéliales UB de crapaud a été déterminée par cytométrie en flux pour l'analyse des nanoparticules. Les diamètres de ces exosomes étaient principalement concentrés dans la plage de 50 à 150 nm (Fig. 4f supplémentaire). Lorsque 1 mg mL-1 de FITC-dextran a été incubé avec des exosomes isolés, les exosomes ne contenaient pas de FITC-dextran (Fig. 4g supplémentaire). En revanche, lorsque le dextran a été ajouté à la culture de cellules épithéliales UB de crapaud dans les mêmes conditions, le FITC-dextran a été identifié dans les exosomes sécrétés par les cellules (Fig. 4g supplémentaire). Cette observation a indiqué que les exosomes isolés n'absorbaient pas le dextrane de 70 kDa, mais que le dextrane était absorbé par les cellules épithéliales UB de crapaud par macropinocytose et libéré des cellules sous forme d'exosomes. Fait intéressant, la proportion d'exosomes contenant du FITC-dextran est restée inchangée dans les cellules épithéliales UB de crapaud avec ou sans l'ajout de βγ-CAT purifié (Fig. 5f), et il n'y avait aucune différence dans l'intensité moyenne de fluorescence de ces exosomes (Fig. 5g ). Ces résultats suggèrent que la βγ-CAT favorise l'exocytose et facilite le transport transcellulaire de substances extracellulaires comme le dextrane en augmentant la libération d'exosomes. Cependant, les propriétés apparentes des exosomes libérés ne semblent pas altérées telles qu'elles sont testées à ce stade.

Les oligomères BmAQP2 et βγ-CAT ont été détectés par Western blot dans des exosomes libérés par des cellules épithéliales UB de crapaud, reflétant la présence de βγ-CAT endogène. L'ajout de βγ-CAT aux cellules a considérablement amélioré la quantité d'oligomères BmAQP2 et βγ-CAT détectés (Fig. 5h). L'IEM a démontré la colocalisation de BmAQP2 et de βγ-CAT dans des exosomes individuels (Fig. 5i). Ces observations suggèrent que βγ-CAT entraîne le recyclage extracellulaire et/ou la communication intercellulaire des AQP via la libération d'exosomes.

De plus, nous avons analysé l'effet de βγ-CAT sur les niveaux de Na+ dans les exosomes des cellules MDCK. Aucune différence n'a été observée pour les concentrations totales de Na + dans les exosomes produits par le même nombre de cellules traitées avec ou sans βγ-CAT 10 nM (Fig. 5j). Cependant, βγ-CAT a augmenté la libération d'exosomes de MDCK de 6, 8 fois (Fig. 4d supplémentaire), de sorte que les concentrations moyennes de Na + des exosomes ont été réduites (Fig. 5k). De plus, une augmentation des concentrations totales de Na + dans les exosomes induites par βγ-CAT a été trouvée dans les milieux hypertoniques dans les mêmes conditions (Fig. 5l).

Les amphibiens vivent à la fois sur terre et dans l'eau, et leur peau est nue et agit comme un organe important dans l'équilibre hydrique, la respiration (échange de gaz) et la défense immunitaire1,3. Bien qu'initialement identifié dans les sécrétions cutanées de B. maxima19, le complexe PFP βγ-CAT est largement exprimé dans les organes de l'équilibre hydrique de B. maxima, y ​​compris la peau, l'UB et les reins (Fig. 1c – h et Supplémentaire Fig. 1c, 1d). Des études antérieures ont indiqué l'expression de βγ-CAT dans divers tissus de B. maxima22,23. Fait intéressant, contrairement à sa puissante cytotoxicité pour diverses cellules de mammifères19,39, la βγ-CAT ne montre des effets toxiques sur les cellules de crapaud qu'à une dose allant jusqu'à 2 μM (Fig. 2b supplémentaire), ce qui est beaucoup plus élevé que les concentrations physiologiques de βγ-CAT observées22 . Sa toxicité pour les cellules de mammifères pourrait refléter l'absence de mécanismes de régulation de cette protéine PFP exogène, qui sont normalement présents chez le crapaud18,21. Ces observations soutiennent l'idée que le complexe PFP βγ-CAT ne peut pas être simplement considéré comme un inducteur de mort cellulaire et/ou un microbicide, et outre ses rôles dans la défense immunitaire22,23,24,25,26, la protéine présente d'autres aspects physiologiques essentiels. fonctions chez ce crapaud.

La peau de B. maxima est recouverte de sécrétions cutanées contenant diverses molécules biologiques qui remplissent une gamme de fonctions physiologiques, notamment des peptides de type hormonal, des peptides antimicrobiens, des af-PFP, des TFF et de l'albumine contenant de l'hème16,40,41. En effet, nos résultats ont révélé que les sécrétions cutanées sont nécessaires pour prévenir la déshydratation (Fig. 1b). Nous avons en outre démontré qu'un composant majeur de la sécrétion cutanée βγ-CAT joue un rôle dans l'homéostasie de l'eau du crapaud dans les organes osmorégulateurs. Bien que la plupart des amphibiens ne vivent pas dans des environnements hypertoniques et que leur peau soit rarement mise à l'épreuve par une perte d'eau extrême, le rein et l'UB sont soumis à une variété de défis hypertoniques dans des conditions physiologiques telles que la formation et la concentration d'urine. En fait, l'expression différentielle de βγ-CAT dans UB avec un environnement osmotique suggère que βγ-CAT est impliqué dans le changement dynamique du transport de l'eau UB (Fig. 1e, f et Fig. 4a). Par conséquent, nous avons en outre démontré que le βγ-CAT joue un rôle dans l'homéostasie de l'eau du crapaud avec les cellules UB du crapaud et les cellules rénales des mammifères. Ce complexe PFP possède la capacité de stimuler et de participer à la macropinocytose (importation) et à la libération d'exosomes (exportation) par les cellules épithéliales des organes osmorégulateurs du crapaud, ce qui favorise le transport de l'eau et du Na+ impliqué dans l'homéostasie de l'eau. Il convient de souligner que puisque B. maxima est une espèce non modèle, il est actuellement difficile d'explorer davantage les effets physiologiques de βγ-CAT au niveau animal au moyen d'inactivation de gène.

Des études antérieures avec des cellules de mammifères et des cellules péritonéales de crapaud ont montré que la βγ-CAT exerce ses actions biologiques par endocytose et la formation de canaux sur les endolysosomes17,21,22,23,24, mais la voie endocytaire de la protéine reste insaisissable. La macropinocytose, également appelée consommation de cellules, est une forme d'endocytose qui médie l'absorption non sélective de liquide extracellulaire et de solutés6,12. Dans un modèle de DC murine, la βγ-CAT augmente l'internalisation de l'ovalbumine (antigène), supposée être médiée par une macropinocytose renforcée24. La présente étude réalisée sur différentes cellules dérivées de crapaud, dont des cellules épithéliales d'organes osmorégulateurs et des cellules péritonéales, a clairement montré que la βγ-CAT est capable d'induire et de participer à la macropinocytose. Il a été démontré que la macropinocytose stimulée par βγ-CAT facilite l'entrée d'eau et de Na + dans les cellules, comme testé dans les cellules épithéliales des organes osmorégulateurs du crapaud (Fig. 2f et Fig. 3f). Cela peut expliquer le rôle de βγ-CAT dans la promotion de la récupération du volume cellulaire sous stress hypertonique (Fig. 2d – f). Étant donné que l'IgG se lie aux récepteurs IgG Fc largement distribués pour induire la pinocytose, comme la protéine FcRn du récepteur IgG de type MHC de classe I, la co-présence d'IgG de lapin exogène non spécifique et de βγ-CAT actif peut entraîner une augmentation de la macropinocytose (Fig. 3b, c et Supplémentaire Fig. 3a, b). La macropinocytose induite par le facteur de croissance est médiée par l'activation des voies de signalisation Ras et PI3-kinase11. De même, l'activation de la signalisation PI3-kinase et Akt était impliquée dans la macropinocytose stimulée par βγ-CAT, comme le suggèrent les effets des inhibiteurs pharmacologiques et l'analyse de la phosphorylation de PI3K et Akt (Fig. 3g – i). Cependant, contrairement aux facteurs de croissance classiques, qui se lient aux récepteurs des protéines membranaires pour initier leur signalisation, le βγ-CAT cible les gangliosides et les sulfatides comme récepteurs dans les radeaux lipidiques pour initier ses effets cellulaires21. Les signaux en aval de ces composants lipidiques et leur relation avec l'induction de la macropinocytose ne sont actuellement pas clairs. A cet égard, les éventuelles différences entre la macropinocytose stimulée par les facteurs de croissance et celle induite par la βγ-CAT doivent être étudiées.

Tout en engloutissant de grands volumes de liquide, la macropinocytose internalise également les protéines de surface cellulaire telles que les récepteurs et les intégrines42,43. Il a été proposé que l'endocytose stimulée par βγ-CAT joue un rôle dans le tri d'éléments spécifiques de la membrane plasmique, tels que des protéines intégrées fonctionnelles ou des composants lipidiques, qui régulent les réponses cellulaires aux variations environnementales17. De plus, l'internalisation et le recyclage des AQP entre la membrane plasmique et le compartiment endosomal jouent un rôle dans le contrôle de l'absorption et de la conservation de l'eau5,28. En conséquence, la colocalisation de βγ-CAT avec les AQP a été observée dans les organites endocytaires (Fig. 4), suggérant que la macropinocytose induite par cette protéine PFP entraîne l'endocytose et le recyclage des AQP. De toute évidence, la présence d'AQP dans la membrane plasmique pourrait faciliter la perte d'eau lorsque les cellules sont confrontées à un stress osmotique hypertonique, ainsi l'internalisation des AQP induite par βγ-CAT pourrait contrer la déshydratation en empêchant l'efflux rapide d'eau et le rétrécissement cellulaire.

La sécrétion de vésicules extracellulaires comprenant des exosomes et des microvésicules représente un nouveau mode de communication intercellulaire et d'échange de matériel38,44. Auparavant, il a été constaté que la βγ-CAT augmentait la libération d'exosomes contenant de la βγ-CAT par les DC murines, ce qui activait efficacement la réponse des lymphocytes T24. La βγ-CAT étant un facteur exogène aux DC murines, l'explication du phénomène n'est pas évidente. Cependant, le PFP est un élément endogène aux cellules de crapaud. La présente étude a illustré que l'exocytose cellulaire sous forme de libération d'exosomes était en effet augmentée en présence de βγ-CAT, comme déterminé dans diverses cellules dérivées de crapaud (Fig. 5d, e et Supplémentaire Fig. 4b, c), révélant que la médiation de l'exocytose cellulaire via la libération d'exosomes est une propriété intrinsèque de cette protéine PFP. Le FcRn exprimé par de nombreuses cellules, qui peut favoriser l'exocytose et le recyclage des IgG45. L'effet d'exocytose de βγ-CAT peut être encore amplifié par l'exocytose et la circulation d'IgG (Fig. 5d et Fig. 4b supplémentaire). Des études antérieures ont démontré que βγ-CAT neutralise de manière caractéristique l'acidification des organites endocytaires contenant cette protéine22,23,24. Ce processus cellulaire peut entraîner la transformation d'organites endocytaires contenant βγ-CAT en MVB qui ne fusionnent pas avec les lysosomes pour la dégradation des solutés contenus. La présence de dextrane extracellulaire en tant que traceur d'endocytose induit par βγ-CAT dans les exosomes contenant βγ-CAT corrobore également le point de vue ci-dessus (Fig. 5f, g).

L'observation que βγ-CAT stimule et participe à la fois à la macropinocytose et à la libération d'exosomes implique fortement que ce PFP est impliqué dans le transport transcellulaire de substances extracellulaires internalisées par l'importation et l'exportation cellulaires induites par le PFP sous des formes vésiculaires par les voies endolysosomales. Cette propriété est particulièrement importante in vivo, où la βγ-CAT pourrait transporter des substances externes telles que l'eau et le Na+ vers les environnements internes des tissus de crapaud sans perturber les jonctions serrées cellulaires qui maintiennent les fonctions de barrière épithéliale. Fait intéressant, des AQP ont été identifiés dans des exosomes libérés en présence de βγ-CAT (Fig. 5h, i), suggérant que βγ-CAT module l'homéostasie de l'eau en entraînant le recyclage extracellulaire et / ou la communication intercellulaire de ces canaux hydriques. Alternativement, l'exocytose médiée par βγ-CAT pourrait fonctionner comme un moyen d'expulsion des solutés nocifs et non digestibles contenus dans le liquide macropinocytosé par les cellules pour l'acquisition d'eau, comme l'expulsion du dextran des cellules épithéliales UB de crapaud (Fig. 5f, g). Le rôle de la βγ-CAT dans l'expulsion des substances nocives englouties par la macropinocytose via l'induction de l'exocytose et le mécanisme de tri cellulaire impliqué sont des défis futurs importants.

Notre étude n'exclut pas l'implication potentielle d'autres mécanismes physiologiques de transport de l'eau, tels que les AQP et les canaux ioniques. En fait, nos résultats soutiennent la possibilité que βγ-CAT puisse jouer un rôle important chez le crapaud B. maxima en participant à la régulation des mécanismes classiques de transport de l'eau, en particulier face au stress osmotique. Il est généralement admis que les protéines classiques intégrées à la membrane telles que les AQP et les canaux ioniques jouent un rôle fondamental dans le transport de l'eau et l'homéostasie28,46. De plus, la protéine de jonction serrée claudine-2 médie la perméabilité aux mouvements transépithéliaux de l'eau sous des gradients osmotiques ou Na+ à travers la voie paracellulaire47,48. La présente étude a introduit un nouvel acteur, une protéine SELC βγ-CAT, dans le réseau de transport et d'homéostasie de l'eau via la modulation de l'importation et de l'exportation de matériel cellulaire par les voies endolysosomales. Un modèle de travail cellulaire du PFP βγ-CAT favorisant l'absorption et le maintien de l'eau a été proposé chez le crapaud B. maxima (Fig. 6). Dans ce modèle, l'eau et le Na+ peuvent être importés par macropinocytose induite par le PFP βγ-CAT. Pendant ce temps, le canal transmembranaire formé par βγ-CAT peut médier le flux de Na + (Fig. 2b, c). Des études antérieures ont montré que le canal formé par βγ-CAT peut provoquer un flux d'ions cationiques39. Le complexe PFP cible l'enveloppe virale pour former des pores qui induisent un efflux d'ions potassium et calcium26. De manière inattendue, les concentrations moyennes de Na + des exosomes contenant du βγ-CAT étaient nettement inférieures à celles du témoin (Fig. 5j, k). Ce phénomène suggère que la présence de canaux formés par βγ-CAT peut conduire à un efflux rapide de Na+ hors des endolysosomes et/ou des exosomes. Ainsi, Na + peut être libéré dans le cytosol via les canaux βγ-CAT dans les organites endocytaires, ce qui entraîne la libération d'eau dans le cytosol via les AQP (Fig. 4). Ceci est similaire à la situation des canaux à deux pores travaillant dans les macrophages de mammifères42,43. La libération accrue d'exosomes médiée par βγ-CAT peut favoriser l'exportation d'ions tels que Na + (Fig. 5l) et / ou d'eau dans les espaces intercellulaires sous les jonctions serrées, favorisant l'absorption d'eau dans des environnements cellulaires plus profonds. Pendant ce temps, les canaux ioniques intégrés à la membrane et les AQP dans la membrane plasmique basale des cellules épithéliales pourraient médier l'efflux de Na + et d'eau dans les tissus internes sous ces cellules, réalisant l'absorption/réabsorption de l'eau dans les tissus internes du crapaud. L'eau potable par macropinocytose est énergétiquement coûteuse12. Cependant, la fonction de PFP βγ-CAT sécrétoire dans l'acquisition et le maintien de l'eau est nécessaire à la lumière des diverses conditions osmotiques auxquelles le crapaud B. maxima doit faire face tout au long de son cycle de vie.

βγ-CAT a réalisé le transport intracellulaire des vésicules et le transport transcellulaire de l'eau, du Na + et de l'AQP2 en favorisant la macropinocytose (importation) et la libération d'exosomes (exportation). Pour une description détaillée, voir le test. La présentation de la couche de cellules épithéliales et du tissu interne est simplifiée. Tous les composants clipart proviennent de PowerPoint 2019 et d'Adobe illustrator CC 2019.

Des PFP sécrétoires ont été identifiés dans des organismes de tous les règnes de la vie14,15,16, et les af-PFP sont largement distribués dans les plantes et les animaux15,16,17. Sur la base d'une multitude de preuves expérimentales sur le complexe βγ-CAT af-PFP et TFF du crapaud B. maxima18,19,20,21,22,23,24,25,26, nous avons proposé l'hypothèse de la voie SELC médiée par un PFP, qui entraîne l'importation et l'exportation de matériel cellulaire par les voies endolysosomales17. La présente étude fournit des preuves fonctionnelles supplémentaires pour soutenir notre hypothèse précédente. Régulée en fonction de signaux environnementaux17,18, il a été démontré que la protéine SELC βγ-CAT favorise l'absorption cellulaire et le transport de matériaux environnementaux, tels que les antigènes, l'eau avec des ions et les composants de la membrane plasmique (voir référence 24 et la présente étude) en s'appuyant sur des contextes cellulaires distincts et environnant, représentant un système de délivrance vésiculaire cellulaire jusqu'alors inconnu. Ces capacités soulèvent la possibilité qu'en plus de travailler dans la présentation des antigènes et le maintien de l'eau, la βγ-CAT et/ou ses homologues pourraient jouer des rôles actifs et fondamentaux dans l'acquisition des nutriments cellulaires et la flexibilité du métabolisme, comme proposé précédemment17, qui sont des sujets intrigants pour une enquête plus approfondie. Ces PFP et les protéines classiques intégrées à la membrane (comme les membres de la famille des porteurs de solutés) peuvent former deux bras cellulaires coordonnés dans la détection, l'échantillonnage et l'acquisition de nutriments extracellulaires. De toute évidence, ces PFP agissant en tant que SELC devraient être essentiels aux cellules dans les cas où les transporteurs classiques de soluté membranaire sont bloqués ou même absents. Nos résultats serviront d'indices pour découvrir de nouvelles stratégies cellulaires et les rôles physiologiques des PFP sur l'importation et l'exportation de matériel via les systèmes endolysosomiques parmi les cellules et les environnements des organismes vivants, en particulier ceux des mammifères.

En conclusion, les travaux actuels ont élucidé un rôle inattendu d'un PFP sécrétoire dans le transport de l'eau et l'homéostasie. βγ-CAT, un complexe af-PFP et TFF, a induit et participé à la macropinocytose et à la libération d'exosomes dans les cellules épithéliales des organes osmorégulateurs de B. maxima. Ces effets pourraient expliquer le rôle du complexe PFP dans la promotion de l'internalisation, du transport et de la libération d'eau, de Na + et d'AQP, travaillant ensemble dans le maintien de la régulation du volume des cellules de crapaud et de l'homéostasie de l'eau (Fig. 6). Associée aux AQP et aux canaux ioniques intégrés à la membrane, l'action de la βγ-CAT sécrétoire peut favoriser la réalisation globale du maintien et de l'équilibre de l'eau, en particulier lorsque le crapaud subit un stress osmotique hypertonique.

Des crapauds (B. maxima) ont été capturés dans la nature et élevés à température ambiante en se nourrissant de Tenebrio molitor vivant. Des crapauds d'un poids moyen de 19 ± 5 g ont été utilisés dans des expériences après avoir jeûné dans une solution de Ringer isotonique pendant 3 jours. Toutes les procédures et les soins et la manipulation des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Institut de zoologie de Kunming, Académie chinoise des sciences (ID d'approbation : IACUC-OE-2021-05-001).

La formulation de la solution isotonique de Ringer (NaCl 111,2 mM, KCl 1,9 mM, CaCl2 1,1 mM, NaHCO3 2,4 mM, MgCl2 1,6 mM) a été modifiée sur la base d'un rapport précédent50. Après le jeûne, les crapauds du groupe hypertonique ont été placés dans une solution de Ringer hypertonique (solution de Ringer avec 222,4 mM de NaCl) pendant 3 heures et leurs changements de poids ont été enregistrés. Les crapauds du groupe hypertonique/isotonique ont ensuite été transférés de la solution de Ringer hypertonique à la solution de Ringer isotonique pendant 3 heures et leurs changements de poids ont été enregistrés. Les changements de poids des crapauds dans la solution isotonique de Ringer ont été enregistrés pendant 6 heures comme référence, appelée groupe isotonique. La peau de certains crapauds a été stimulée électriquement (4,5 V DC, durée d'impulsion 10 ms) pendant 3 minutes pour épuiser les sécrétions cutanées, et les crapauds ont été placés dans une solution isotonique de Ringer pendant 30 minutes. Leurs taux de survie ont ensuite été enregistrés après 48 heures dans des solutions isotoniques et hypertoniques.

Des cellules épithéliales de crapaud ont été obtenues par digestion tissulaire. Plus précisément, les tissus UB, cutanés et rénaux de B. maxima ont été disséqués sur cinq crapauds dont la moelle épinière avait été détruite. Les tissus ont ensuite été rincés et dépouillés dans la solution de Ringer pour éliminer le sang résiduel, le mucus et d'autres impuretés. Ils ont ensuite été coupés en morceaux et lavés deux fois dans une solution de Ringer, suivi d'une digestion oscillatoire avec de la trypsine à température ambiante pendant 40 minutes. Les cellules ont été séparées avec un tamis de 200 mesh dans un tube à centrifuger de 50 ml (Jet Biofil, Cat CFT011500). De plus, des cellules péritonéales de crapaud ont été extraites du liquide péritonéal de B. maxima. Toutes les cellules ont été enrichies par centrifugation à 2 000 tr/min pendant 5 min à 4 °C. Les cellules digestives de la peau de crapaud et des tissus UB contiennent environ 90 % et 60 % des cellules épidermiques, respectivement, comme analysé par cytométrie en flux à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-pan cytokératine AE1/AE3 (Invitrogen, Cat 53-9003-80).

Les lignées cellulaires de rein canin Madin-Darby (MDCK), Caco-2, HEK293 et ​​T24 ont été achetées auprès de la Kunming Cell Bank, Académie chinoise des sciences. Les cellules ont été cultivées dans du DMEM/F-12 (Biological Industries, Cat 01-172-1 A) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (Biological Industries, Cat 04-001-1 A) et 1 % de chlorhydrate de lévofloxacine et injection de chlorure de sodium. Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées et cultivées jusqu'à confluence dans des flacons de culture tissulaire revêtus de collagène de queue de rat de type I (Jet Biofil, Cat TCD010100) à 37 ° C et 5% de CO2 en atmosphère humide.

La purification et l'analyse de pureté de la βγ-CAT ont été réalisées selon la description précédente19,22.

Le test MTS a été utilisé pour détecter la cytotoxicité de βγ-CAT. En bref, les lignées cellulaires MDCK et T24 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à 1 × 104 cellules par puits et cultivées pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de CO2. Les cellules ont été incubées avec le réactif MTS (Promega, Cat G3580) dans l'obscurité pendant 1 heure après traitement avec βγ-CAT à température ambiante pendant 2 heures. L'absorbance du surnageant de culture de cellules de crapaud a été mesurée avec 2 x 106 cellules par puits. L'absorption a été détectée à 490 nm avec le lecteur de microplaques Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suisse).

2 x 107 cellules de peau de crapaud, UB, rénales ou péritonéales ont été enrichies par centrifugation puis lavées trois fois avec 5 ml de solution de Ringer jusqu'à ce que le surnageant n'ait plus d'activité hémolytique sur les érythrocytes humains. La suspension de cellules de crapaud a été remise en suspension en quatre groupes. Le groupe témoin non cultivé a été centrifugé et le surnageant a été recueilli. Les trois autres groupes ont été incubés à température ambiante pendant 1,5 heure et centrifugés pour recueillir le surnageant. L'un d'eux servait de groupe cultivé. Les deux lots restants ont été mélangés avec 50 μg mL-1 d'anticorps de lapin ou d'anticorps anti-βγ-CAT dérivés de lapin, respectivement, et incubés à température ambiante pendant 30 minutes, tandis que les groupes non cultivés et cultivés ont été traités de manière similaire en utilisant le même volume de La solution de Ringer. Des érythrocytes humains ont été ajoutés au surnageant à une concentration de 3 %, incubés pendant 30 minutes à 37 °C, puis centrifugés à 2 000 tr/min pendant 5 minutes. L'absorption a été détectée à 540 nm avec le lecteur de microplaques Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suisse).

Les méthodes décrites précédemment ont été modifiées selon les besoins51. En bref, des cellules MDCK, Caco-2 et T24 digérées ont été cultivées dans un milieu sans sérum pendant 30 minutes à une concentration de 2 x 106 cellules par ml avant détection. Pour déterminer les diamètres cellulaires, nous avons traité les cellules MDCK, Caco-2 et T24 avec du PBS hypertonique (l'ajout de NaCl à 0,01 M de PBS a augmenté la pression osmotique à 400 mOsm) contenant du βγ-CAT purifié à des doses de 10 nM, 10 nM et 5 nM, respectivement . Les cellules épithéliales de crapaud UB ont été incubées avec ou sans HgCl2 0,3 mM pendant 10 minutes à une concentration de 2 × 106 cellules par ml après incubation avec 50 μg ml-1 d'anticorps anti-βγ-CAT dérivés de lapin pendant 30 minutes à température ambiante. Des changements de diamètre des cellules épithéliales UB de crapaud ont été détectés dans une solution de Ringer isotonique ou hypertonique. La concentration finale de toutes les cellules était de 1 x 106 cellules par ml. Le diamètre moyen des cellules a été déterminé par un compteur de cellules automatisé Countstar (ALIT Life Science, Shanghai, Chine).

Les courants ont été enregistrés sur des cellules HEK293 avec la configuration extérieur-extérieur de la technique patch-clamp à température ambiante avec un amplificateur Multiclamp 700B et un convertisseur analogique-numérique Digidata 1550A contrôlé par un logiciel pClamp10 (Molecular Devices, San Jose, USA). La solution de pipette contenait 150 mM de KCl, 10 mM d'HEPES, 1 mM d'EGTA, pH 7,4 ; la solution de bain contenait 150 mM de NaCl, 10 mM d'HEPES, pH 7,4. Le courant de fond (blanc) et macroscopique induit par 100 nM βγ-CAT ont été enregistrés sous un protocole de rampe de 500 millisecondes entre -100 mV et + 100 mV toutes les 2 secondes à partir d'un potentiel de maintien de 0 mV. Pour les expériences de remplacement, la solution de pipette contenait 150 mM de NaCl, 10 mM d'HEPES, 1 mM d'EGTA, pH 7,4 ; la solution de bain contenait du NaCl 150 mM ou 15 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. Tous les courants indiqués ont été soustraits. Les données ont été analysées avec pClamp10 et GraphPad Prism 8.

Les niveaux d'ARNm de βγ-CAT-α et βγ-CAT-β dans la peau de crapaud, l'UB et les reins ont été détectés par qRT-PCR à l'aide d'un kit Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) (Yeasen, Cat 11201ES03). Les comptages de cycles des gènes cibles ont été normalisés à ceux de la β-actine. Les niveaux d'ARNm de FcRn dans les cellules de crapaud de la peau, de l'UB, des reins et de la cavité péritonéale ont également été détectés par RT-PCR. Les séquences d'amorces de cette étude sont présentées dans le tableau supplémentaire 1.

Les réactions de marquage ont été réalisées conformément à une procédure précédemment décrite avec quelques modifications52. La βγ-CAT purifiée a été dialysée pendant une nuit dans une solution de réticulation (NaHCO3 7,56 g, Na2CO3 1,06 g et NaCl 7,36 g dissous dans 1 L d'eau; pH 9,0) à l'aide d'une membrane de dialyse de 3 500 Da (Biosharp, Cat BS-QT- 021), et 1 mg de RBITC (Sigma, Cat 283924) a été dissous dans 1 mL de DMSO (Sigma, Cat D2650). La solution RBITC a été ajoutée lentement à βγ-CAT pour donner βγ-CAT : RBITC = 1 mg: 150 μg et l'échantillon a été incubé pendant une nuit à 4 ° C, à l'abri de la lumière. Du NH4CI (50 mM) a été ajouté et la solution a été incubée à 4°C pendant 2 heures pour terminer la réaction. Les échantillons dialysés ont été concentrés à 1 mg mL-1 avec du PBS et conservés à 4 °C dans l'obscurité.

Des ajustements appropriés ont été utilisés sur une description précédente53. En bref, les cellules MDCK ont été cultivées à 90 % sur une lame de verre à 24 puits. Des sections fixées au paraformaldéhyde d'échantillons de tissus de crapaud et d'analyses cellulaires ont été traitées avec 0,5 % de TritonX-100. Après blocage pendant 2 heures dans du PBS contenant 2 % de BSA à 37 °C, les tissus et les cellules ont été incubés avec des anticorps primaires anti-AQP2 de souris (Santa Cruz, Cat sc-515798) ou de lapin anti-βγ-CAT pour 2 heures à 37°C. Les cellules ont été incubées dans l'obscurité avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence pendant 1 heure à 37°C après trois lavages avec du PBS. Les échantillons ont été scellés avec un agent d'extinction anti-fluorescent contenant du DAPI. La localisation de βγ-CAT ou BmAQP2 dans les tissus de crapaud a été déterminée en utilisant des anticorps primaires anti-AQP2 dérivés de lapin (ImmunoWay, Cat YT0290) et des anticorps primaires anti-βγ-CAT dérivés de souris.

Les cellules MDCK ont été traitées avec une dose de 10 nM de RBITC-βγ-CAT, dans du PBS 0, 01 M avec ou sans 1 mg mL-1 de dextran marqué FITC (Sigma, Cat 46945) pendant 15 minutes à 37 ° C. Après trois lavages avec du PBS, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 minutes, puis traitées avec du TritonX-100 à 0,5 % pendant 15 minutes. Les échantillons ont été scellés avec un agent d'extinction anti-fluorescent contenant du DAPI.

Les images de la figure 4b ont été acquises par un système de microscope laser confocal Nikon A1 (Nikon, Tokyo, Japon). Les images des Fig. 1g, h, Fig. 4a et du supplément Fig. 3g ont été acquises par un système de microscope Zeiss LSM 880 (Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne).

La méthode pour isoler les exosomes a été optimisée sur la base d'une description précédente24. En bref, les cellules MDCK et T24 ont été cultivées à 90 % sur des boîtes de culture cellulaire de 100 mm. Les cellules ont été cultivées dans vingt boîtes de culture cellulaire avec et sans βγ-CAT 10 nM ou 5 nM pendant 3 heures à 37 ° C. Le surnageant cellulaire (200 ml) a été recueilli pour une centrifugation en gradient (300 × g pendant 30 minutes ; 500 × g pendant 30 minutes ; 2 000 × g pendant 30 minutes ; 10 000 × g pendant 40 minutes) à 4 °C pour éliminer les cellules résiduelles, les débris et microvésicules. Les exosomes ont été obtenus par ultracentrifugation à 100 000 × g avec le rotor P100AT2 pendant 2 heures à 4 ° C, puis remis en suspension dans du PBS et enrichis à nouveau dans l'ultracentrifugeuse préparative CP100WX (HATACHI, Tokyo, Japon). Les exosomes enrichis ont été stockés à -80 ° C pour des expériences de suivi.

Des crapauds sains B. maxima ont été utilisés pour prélever des tissus et les broyer pour obtenir des cellules. 2 × 107 cellules obtenues à partir de trois crapauds ont été cultivées dans 10 mL de solution de Ringer contenant soit 50 nM βγ-CAT, 50 μg mL-1 d'IgG de lapin ou 50 μg mL-1 d'anticorps anti-βγ-CAT dérivés de lapin pendant 3 heures à la pièce température. Les exosomes ont été extraits avec le kit d'isolation d'exosomes Hieff Quick (Yeasen, Cat 41201-A). Le surnageant cellulaire a été obtenu par une série de centrifugations en gradient (500 × g pendant 10 minutes ; 3 000 × g pendant 10 minutes). Il a été soigneusement mélangé avec un quart de volume du réactif à 4 ° C pendant 2 heures, puis centrifugé à 10 000 × g pendant 1 heure pour collecter les exosomes. Après remise en suspension dans la solution de Ringer, le liquide contenant les exosomes a été centrifugé à 100 000 × g avec le rotor P100AT2 pendant 2 heures à 4 ° C, et répété une fois dans une ultracentrifugeuse préparative CP100WX (HATACHI, Tokyo, Japon). Les exosomes enrichis ont été stockés à -80 ° C pour des expériences de suivi.

2×105 cellules MDCK et T24 ont été incubées avec 100 μg mL−1 70 kDa dextran marqué FITC (Sigma, Cat 46945) ou Lucifer Yellow (Sigma, Cat L0144) dans l'obscurité à 37 °C pendant 30 minutes avec et sans 10 nM ou 5 nM βγ-CAT, respectivement. Les échantillons ont été suivis par détection de fluorescence de FITC ou AmCyan. Dans chaque échantillon, 1 x 104 cellules individuelles ont été analysées. 2 × 106 cellules épithéliales UB de crapaud et cellules péritonéales ont été traitées avec 50 nM de βγ-CAT, tandis que 100 nM de βγ-CAT ont été utilisés pour 2 × 106 cellules de peau et de rein de crapaud. Dans le test utilisant l'immunodéplétion de βγ-CAT endogène, des cellules de crapaud ont été incubées avec 50 μg mL-1 d'anticorps anti-βγ-CAT dérivés de lapin pendant 30 minutes avant la réalisation du protocole ci-dessus. Pour tester l'effet non spécifique de l'IgG de lapin exogène, des cellules MDCK ont été incubées avec 50 μg mL-1 d'IgG de lapin ou d'anticorps anti-βγ-CAT dérivé de lapin pendant 30 minutes avant le protocole ci-dessus. Au cours de l'expérience d'inhibition, les cellules ont d'abord été incubées avec 100 μM d'EIPA (MedChemExpress, Cat HY-101840A) ou 20 μM de wortmannine (Sigma, Cat 681675) pendant 1 heure à 37 ° C. De plus, 2 × 106 cellules épithéliales UB de crapaud digérées ont été cultivées in vitro pendant 3 heures et co-incubées avec 500 ng mL-1 d'iodure de propidium (BD Pharmingen, Cat 556547) pendant 10 minutes à température ambiante. La fluorescence a été enregistrée à l'aide de l'analyseur de cellules LSR Fortessa (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Les données ont été analysées par FlowJo 10 et GraphPad Prism 8.

Les exosomes des cellules épithéliales UB de crapaud ont été isolés comme décrit dans "Isolation des exosomes". Des exosomes ou 2 × 107 cellules épithéliales de crapaud UB ont été cultivées dans un milieu contenant 1 mg mL-1 de dextrane marqué au FITC avec ou sans βγ-CAT 50 nM à température ambiante pendant 3 heures. Les exosomes des cellules épithéliales UB de crapaud ont été enrichis et le dextrane résiduel a été lavé en utilisant la méthode décrite dans "Isolation des exosomes". Toutes les expériences ont été faites dans l'obscurité. La fluorescence et la distribution granulométrique ont été enregistrées à l'aide de Flow NanoAnalyzer (NanoFCM, Xiamen, Chine). Les données ont été analysées par FlowJo 10 et GraphPad Prism 8.

Les expériences étaient basées sur le rapport précédent54. Les échantillons de tissus ont été fixés pendant la nuit avec du PB 0,1 M (pH 7,4) contenant 3 % de paraformaldéhyde 0,1 % de glutaraldéhyde à 4 °C, lavés avec du PB 0,1 M quatre fois pendant 15 minutes, puis lavés avec de la glycine 0,1 M dans du PB 0,1 M pendant 30 minutes. à 4 °C. Après déshydratation par gradient d'éthanol, l'échantillon a été enrobé dans de la résine blanche LR (Sigma, Cat L9774) et polymérisé à 55 ° C pendant 24 heures. Des coupes ultrafines de 100 nm ont été préparées à l'aide d'un ultramicrotome EM UC7 (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) et chargées sur des grilles Ni de 200 mesh (EMCN, Cat BZ10262Na). Les exosomes enrichis ont été directement attachés aux grilles de Ni pendant 10 minutes avant le traitement expérimental. Les échantillons ont été lavés avec de l'eau déminéralisée pendant 2 minutes puis bloqués avec 1 % de BSA pendant 5 minutes. Après une nuit d'incubation avec des anticorps primaires anti-βγ-CAT dérivés de souris ou anti-AQP2 dérivés de lapin (ImmunoWay, Cat YT0290) à 4 ° C, les échantillons ont été lavés 10 fois avec de l'eau déminéralisée. Ensuite, les échantillons ont été incubés avec un anticorps secondaire conjugué à l'or colloïdal de 5 nm ou 10 nm (Sigma, Cat G7527 et G7402) à température ambiante pendant 2 heures et lavés 10 fois à température ambiante. Les exosomes ont été colorés avec de l'acétate d'uranyle à 2 % pendant 3 minutes, et les coupes ont été colorées avec de l'acétate d'uranyle à 2 % pendant 7 minutes et du citrate de plomb pendant 5 minutes avant observation en utilisant un microscope électronique à transmission JEM 1400 plus à 100 kV.

2 x 107 cellules épithéliales de crapaud UB enrichies par centrifugation ont été remises en suspension avec une solution de Ringer (de la N-méthyl-D-glucamine a été utilisée à la place du NaCl) après digestion et lavage 3 fois. Les cellules MDCK ont été cultivées à 90 % sur des boîtes de culture cellulaire de 100 mm, et trois boîtes de culture cellulaire de chaque groupe ont été utilisées dans cette expérience. Des cellules épithéliales de crapaud UB et des cellules MDCK ont été cultivées pendant 3 heures avec et sans 50 nM ou 10 nM de βγ-CAT, respectivement. Les cellules ont été recueillies et lysées avec de l'eau déminéralisée. Les concentrations de sodium dans les exosomes MDCK ont été mesurées dans des dosages isotoniques ou hypertoniques en utilisant respectivement quarante ou vingt boîtes de culture cellulaire dans chaque groupe. Les exosomes MDCK ont été isolés comme décrit dans "Isolation des exosomes". Les échantillons ont été congelés dans de l'azote liquide, puis lentement fondus à température ambiante, et répétés deux fois. Un broyage cellulaire par ultrasons (puissance 200 W, travail toutes les 10 secondes pendant 5 secondes, 40 cycles) a été utilisé pour libérer l'échantillon jusqu'à ce que le liquide soit transparent. Les impuretés des échantillons ont été éliminées par centrifugation en gradient (2 000 × g pendant 30 minutes ; 10 000 × g pendant 1 heure). Une fois l'échantillon filtré avec un filtre de 0,22 μm, la concentration d'ions sodium dans les échantillons a été déterminée par le spectromètre d'émission optique à plasma à couplage inductif iCAP6300 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis d'Amérique).

Tous les échantillons d'exosomes ont été dilués à environ 1 × 107 particules par ml avec du PBS. La taille des particules et la concentration des exosomes ont été mesurées par ZetaView PMX 110 (Particle Metrix, Meerbusch, Allemagne), et les données ont été analysées à l'aide du logiciel ZetaView 8.04.02.

Pour mesurer le niveau de protéines de βγ-CAT ou AQP2, des cellules épithéliales de crapaud UB, des cellules MDCK, Caco-2 et T24 ont été traitées pendant 15 minutes avec ou sans 50 nM, 10 nM, 10 nM et 5 nM de βγ-CAT, respectivement. L'Akt total et le phospho-Akt ont été détectés en traitant des cellules MDCK avec ou sans βγ-CAT 10 nM pendant 30 minutes ou 60 minutes. Les exosomes des cellules épithéliales UB de crapaud ont été lavés avec une solution de Ringer et récoltés par un tampon de lyse RIPA sur de la glace. L'anti-βγ-CAT dérivé du lapin, l'anti-AQP2 dérivé du lapin (ImmunoWay, Cat YT0290), l'anti-CD63 dérivé de la souris (Abcam, Cat ab193349), l'anti-TSG101 dérivé du lapin (Proteintech, Cat 28283-1- AP), anti-flotilline 1 dérivée de lapin (Proteintech, Cat 11571-1-AP), anti-PI3 Kinase p85 dérivée de lapin (CST, Cat 4257), anti-phospho-PI3 Kinase p85 dérivée de lapin (CST, Cat 4228), anti-Rac1/2/3 dérivé du lapin (CST, Cat 2465), anti-total Akt dérivé du lapin (CST, Cat 4691) et anti-phospho-Akt-S473 dérivé du lapin (CST, Cat 4060) des anticorps primaires ont été utilisés dans ces expériences.

L'histoire évolutive a été déduite en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance basée sur le modèle de correction de Poisson55. Les arbres initiaux pour la recherche heuristique ont été obtenus automatiquement en appliquant les algorithmes Neighbor-Join et BioNJ à une matrice de distances par paires estimées à l'aide d'un modèle JTT, puis en sélectionnant la topologie avec une valeur de log de vraisemblance supérieure56. L'analyse évolutive a été menée dans MEGA7. De plus, l'analyse de l'alignement des séquences des AQP chez le crapaud B. maxima et d'autres espèces a été effectuée par Clustal Omega.

Les données de survie des animaux ont été analysées par le test de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Toutes les autres données ont été analysées à l'aide du test t non apparié standard. Les différences avec des valeurs P < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 8.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les sources de toutes les données à l'appui des résultats de cette étude sont citées dans le texte principal, dans les figures supplémentaires et dans le tableau supplémentaire 1. Images de transfert/gel non recadrées et non éditées en tant que fig. 5 à l'information supplémentaire. Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude actuelle sont disponibles dans le référentiel de données Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.0p2ngf226)57. Tous les composants clipart de la Fig. 6 proviennent de PowerPoint 2019 et d'Adobe illustrator CC 2019.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 31872226, U1602225 et 31572268) et le programme Yunling Scholar à Yun Zhang. Nous tenons à remercier le Centre régional d'instruments de diversité biologique de Kunming, l'Institut de zoologie de Kunming, l'Académie chinoise des sciences pour notre microscopie électronique et nous serions reconnaissants à Ying-Qi Guo pour son aide dans la fabrication d'échantillons EM.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Zhong Zhao, Zhi-Hong Shi.

Laboratoire clé des modèles animaux et des mécanismes de maladies humaines de l'Académie chinoise des sciences/Laboratoire d'ingénierie des peptides de l'Académie chinoise des sciences, Institut de zoologie de Kunming, Académie chinoise des sciences, Kunming, Yunnan, 650201, Chine

Zhong Zhao, Zhi-Hong Shi, Chen-Jun Ye et Yun Zhang

Kunming College of Life Science, Université de l'Académie chinoise des sciences, Kunming, Yunnan, 650204, Chine

Zhong Zhao et Zhi-Hong Shi

Institut des sciences médicales fondamentales, Académie chinoise des sciences médicales et Collège médical de l'Union de Pékin, Pékin, 100005, Chine

Zhong Zhao

Centre d'excellence en évolution et génétique animales, Académie chinoise des sciences, Kunming, Yunnan, 650201, Chine

Yun Zhang

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Ces auteurs ont contribué à parts égales à ce travail : ZZ et ZHS Correspondance à YZYZ, ZZ et ZHS ont conçu et conceptualisé l'étude ; ZZ, ZHS et CJY ont réalisé les expériences, ZZ, YZ, ZHS et CJY ont analysé et interprété les données ; ZZ, YZ, ZHS ont écrit le manuscrit ; YZ, ZZ, ZHS et CJY ont révisé de manière critique le manuscrit pour un contenu intellectuel important.

Correspondance à Yun Zhang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la gestion principale : Luke R. Grinham. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Zhao, Z., Shi, ZH., Ye, CJ. et coll. Une protéine porogène entraîne la macropinocytose pour faciliter le maintien de l'eau du crapaud. Commun Biol 5, 730 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03686-1

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Reçu : 17 août 2021

Accepté : 07 juillet 2022

Publié: 22 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-03686-1

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