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Molecular Psychiatry volume 27, pages 4905–4917 (2022)Citer cet article

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Le gel est un comportement défensif conservé qui constitue un mécanisme majeur d'adaptation au stress. Des décennies de recherche ont démontré le rôle de l'amygdale, du gris périaqueducal et de l'hypothalamus en tant qu'actionneurs principaux du contrôle des réponses de peur, y compris le gel. Cependant, le rôle que d'autres sites modulateurs fournissent à cet échafaudage câblé n'est pas connu. Ici, nous montrons que la congélation provoquée par l'exposition aux chocs électriques du pied active les neurones GABAergiques du tegmentum latéro-dorsal (LDTg) se projetant vers le VTA, sans altérer l'excitabilité des neurones LDTg cholinergiques et glutamatergiques. Le silence chimiogénétique sélectif de cette projection inhibitrice, mais pas des autres sous-types neuronaux LDTg, atténue les réponses de congélation mais n'empêche pas la formation de souvenirs de peur conditionnés. À l'inverse, l'activation optogénétique des terminaux LDTg GABA dans le VTA entraîne des réponses de congélation et provoque une bradycardie, une caractéristique commune de la congélation. Notamment, cette information aversive est ensuite transmise du VTA à l'amygdale via une voie GABAergique discrète. Par conséquent, nous avons dévoilé un mécanisme de circuit reliant les régions LDTg-VTA-amygdale, qui détient une pertinence translationnelle potentielle pour les états de congélation pathologiques tels que les troubles de stress post-traumatique, les attaques de panique et les phobies sociales.

Le stress est un moteur clé de l'adaptation. La réponse au stress est surtout bénéfique car elle favorise la survie. Chaque fois qu'un organisme vivant est confronté à un stimulus environnemental stressant tel qu'une menace, il active des circuits cérébraux dédiés pour sélectionner la réponse la plus adaptative parmi un répertoire diversifié de comportements défensifs [1]. Ces réponses innées et apprises ont été façonnées par la sélection naturelle et conservées à la fois chez les invertébrés et les vertébrés. Les comportements défensifs varient en fonction de la nature du stimulus ainsi que de facteurs internes tels que l'inhibition comportementale et les traits d'anxiété [2, 3]. En termes de résultats comportementaux, les comportements défensifs vont des stratégies passives telles que le gel aux réponses actives de combat ou de fuite, et le passage entre ces modes passif/actif est essentiel pour la flexibilité comportementale [1, 4, 5].

Le gel est une réaction de peur universelle caractérisée par une absence totale de mouvement, à part la respiration, en raison d'une posture corporelle tendue lorsqu'une menace est rencontrée. Le gel est cardinal dans les processus de gestion du stress car il correspond à un état d'hypervigilance, permettant la prise de décision et par conséquent la construction de la stratégie comportementale la plus pertinente. Bien que le gel soit pertinent pour l'étiologie des troubles liés à la menace tels que les troubles de stress post-traumatique (SSPT), les attaques de panique et les phobies sociales [6,7,8,9], les circuits neuronaux et les substrats cellulaires sous-jacents sont loin d'être compris. . Un grand nombre de preuves indiquent que les structures cérébrales telles que le gris périaqueducal (PAG), l'hypothalamus ou le complexe amygdaloïde jouent un rôle majeur dans la détection, l'intégration et la réponse aux menaces inconditionnées et conditionnées chez les rongeurs et les humains [2, 10 , 11]. En effet, des décennies de travail utilisant différentes approches allant des lésions, des interventions pharmacologiques et des stimulations électriques aux outils opto- et pharmacogénétiques plus récents ont positionné l'amygdale comme une unité centrale dans ce réseau hiérarchique du système défensif de la peur [11]. L'amygdale latérale calcule les informations à partir des entrées sensorielles et associatives des cortex et des noyaux thalamiques qui sont transmises au noyau de sortie central de l'amygdale [2, 11]. Ce dernier influence l'activité du PAG et des voies hypothalamiques pour ensuite influencer l'activité de la moelle et du pont entraînant des modifications de la fonction des viscères, de la contraction musculaire et de la sensibilité à la douleur [12]. Pourtant, à la lumière de l'impact du stress sur le cerveau, l'adaptation au stress est susceptible de recruter des réseaux cérébraux modulateurs clés, qui pourraient façonner les réponses de blocage. La découverte de ces voies est une étape importante pour bien comprendre l'étiologie des réactions de peur telles que le gel, et pour construire une carte fonctionnelle complète de ces régions sous-corticales et corticales interconnectées sous-jacentes. Chez l'homme, ce réseau défensif distribué peut subir une activation indue et des dérégulations persistantes entretenues par des modifications épigénétiques et synaptiques, qui se manifestent cliniquement par des états de détresse intense, des réactions péri-traumatiques et un SSPT [13].

Le noyau tegmental latérodorsal (LDTg) est interconnecté avec les régions limbiques et répond aux stimuli somatosensoriels, visuels et auditifs [14]. Bien que principalement étudié pour son rôle dans les comportements axés sur la récompense [15, 16, 17] et le sommeil paradoxal [18, 19], des travaux récents indiquent que le LDTg peut véhiculer des informations liées au stress [20, 21]. Le LDTg constitue un puissant modulateur de l'équilibre motivationnel régulant les comportements appétitifs et à valence négative. Dans le cadre de la formation réticulaire, le LDTg contribue également à l'excitation comportementale facilitant ainsi l'intégration sensorielle [22, 23], qui est un élément clé affectant les réponses de peur. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que le LDTg pourrait contribuer à un comportement défensif tel que le gel des réponses. Pour tester cela, nous avons combiné des enregistrements électrophysiologiques in vivo et ex vivo et des analyses comportementales pour évaluer la congélation induite par des chocs électriques. Pour lier de manière causale le LDTg aux réponses de congélation, nous avons utilisé des approches pharmacogénétiques et optogénétiques dans des circuits cérébraux marqués par des virus. Nous découvrons une voie non canonique impliquant la projection GABAergique LDTg vers la zone tegmentale ventrale (VTA), qui a ensuite un impact sur les neurones amygdaliens pour réguler les réponses de congélation inconditionnées.

Toutes les procédures étaient conformes aux recommandations de la Commission européenne (2010/63/UE) pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par le Comité national d'éthique français (#9185-2017020911476246 et #16459-2018061116303066). Nous avons utilisé des souris mâles C57BL/6J (Janvier Labs, France), des souris vGAT-CRE (The Jackson Laboratory, numéro de stock : 028862), des souris vGluT2-CRE [24] et des souris ChAT-CRE (The Jackson Laboratory, numéro de stock : 006410). Les souris transgéniques étaient hétérozygotes et rétrocroisées sur un fond C57BL/6J. Les souris ont été logées 4 à 5 souris par cage sur un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 ​​h avec des lumières allumées de 8h00 à 20h00. Les souris avaient libre accès à la nourriture et à l'eau ad libitum. L'habitat enrichi se composait d'un billot de bois à mâcher, d'un igloo en plastique et de coton pour faciliter la nidification. Toutes les souris utilisées dans les expériences comportementales ont été manipulées quotidiennement pendant 1 semaine avant chaque test pour limiter tout stress induit par les injections intrapéritonéales et les connexions aux câbles laser pour l'expérience optogénétique in vivo. Tous les tests ont été effectués sur des souris adultes âgées d'au moins 2 mois et des compagnons de portée ont été utilisés comme témoins. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives ARRIVE.

La clozapine-N-oxyde (CNO) a été achetée chez Enzo Life (France), la kétamine et la xylazine chez Centravet (France) et la picrotoxine chez Sigma-Aldrich (France). Tous les médicaments destinés à l'administration in vivo ont été dilués dans une solution saline de NaCl à 0,9 %. Les souris ont reçu soit une solution saline (10 ml/kg) soit du CNO (1 mg/kg) comme décrit précédemment dans la réf. [20].

Les virus ont été achetés auprès des installations suivantes : Addgene (plasmide #50475 AAV8-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry, plasmide #44362 AAV8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry, plasmide #44361 AAV8-hSyn-DIO-hM3D (Gq)-mCherry, plasmide #20298 AAV5-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA, plasmide #20297 AAV5-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA) et Plateforme de vectorologie de Montpellier (Adénovirus canin de type 2, CAV-2-Cre). Pour la modulation d'une manière spécifique à la projection et au type de cellule, nous avons utilisé des virus de l'installation de base de vecteurs de Zurich (identifiant : v190-8 AAV-8/2-hSyn1-dFRT-hM4D(Gi)-mCherry(rev)-dFRT-WPRE- hGHp(A), identifiant : v171-retrograde ssAAV-retro/2-hSyn1-chI-dlox-EGFP_2A_FLPo(rev)-dlox-WPRE-SV40p(A)), le titre pour les AAV et le CAV-2-Cre était ≥ 1 012 ppl /mL et ≥1013 ppm/mL respectivement.

Les injections stéréotaxiques ont été réalisées à l'aide d'un cadre stéréotaxique (Kopf Instruments). L'anesthésie générale a été réalisée en utilisant un mélange de kétamine (150 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Tous les virus ont été injectés bilatéralement à un débit de 100 nL/min pour un volume final de 200 nL par site (sauf pour VTA pour lequel nous avons injecté 300 nL). Les souris étaient âgées de 5 à 6 semaines au moment de la chirurgie et ont reçu au moins une période de récupération de 3 semaines pour les expériences pharmacogénétiques et de 6 semaines pour les tests optogénétiques afin de permettre une expression virale suffisante. Les coordonnées stéréotaxiques (antéro-postérieures : AP ; médiolatérales : ML ; dorsoventrales : DV) étaient basées sur l'atlas de Paxinos du cerveau de souris adultes [25], et adaptées au fur et à mesure que nous effectuions des chirurgies sur de jeunes souris. Ils sont donnés ici en millimètres (mm) à partir du bregma pour les coordonnées AP et ML, DV est pris à partir du crâne au site d'injection. Les coordonnées étaient les suivantes : LDTg : AP -4,70, ML ± 0,50, DV -3,60 ; VTA : AP -2,80, ML ± 0,60, DV -4,70 ; CeA : AP -0,75, ML ± 3,00, DV -5,05 ; vlPAG : AP -4,00, ML ± 0,60, DV -2,50 ; BLA : AP -1,30, ML ± 3,20, DV -4,60 ; LS : AP + 1,0, ML ± 0,2, DV -3,35.

Pour faire taire les neurones LDTg, un AAV8-hSyn-hM4D(Gi)mCherry a été injecté bilatéralement dans le LDTg de souris C57Bl6J.

Pour faire taire spécifiquement les neurones cholinergiques, glutamatergiques et GABAergiques du LDTg, un AAV8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)mCherry a été injecté bilatéralement dans le LDTg des souris ChATCre, vGluT2Cre et vGATCre respectivement.

Pour le silençage spécifique à la projection, des souris de type sauvage ont été injectées bilatéralement avec CAV-2-Cre dans le gris périaqueducal (PAG), l'amygdale centrale (CeA) ou VTA et avec un hSyn-DIO-hM4D (Gi) -mCherry dans le LDTg (ci-après dénommées souris LDTghM4→PAG, LDTghM4→CeA, LDTghM4→VTA). Pour la manipulation sélective des projections VTAg → BLA, nous avons injecté bilatéralement un CAV-2-Cre dans le BLA et un hSyn-DIO-hM4D (Gi) -mCherry dans le VTA.

Pour activer sélectivement LDTg sur les projections VTA, nous avons injecté un CAV-2-Cre dans le VTA et un hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry dans le LDTg de souris de type sauvage (ci-après nommé LDTghM3→VTA).

Pour la manipulation spécifique à la projection et aux neurotransmetteurs, des souris vGATCre ont reçu une injection bilatérale d'un AAV-retro/2-hSyn1-chI-dlox-EGFP_2A_FLPo(rev)-dlox-WPRE-SV40p(A) dans le VTA et un AAV-8 /2-hSyn1-dFRT-hM4D(Gi)-mCherry(rev)-dFRT-WPRE-hGHp(A) dans le LDTg (ci-après nommé GAThM4 ; LDTg→VTA).

Des fibres optiques (coeur 200 μm, 0,39 NA, réalisées selon le protocole de [26] ont été implantées bilatéralement dans la VTA avec un angle de 15° (AP : −2,8 mm ; ML : −1,5 mm ; DV : −4,2 mm), 4 –5 semaines après l'injection virale Les fibres optiques ont été connectées par un manchon de raccordement (ThorLabs, ADAL1-5) à des cordons de raccordement (Doric Lenses, MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25(F)) à une fibre optique joint tournant (lentilles doriques FRJ_1x2i_FC-2FC_0.22) lui-même connecté à une source laser (ThorLabs S1FC473MM).Les souris ont été habituées à la connexion par fibre optique pendant 30 min par jour pendant la semaine précédant les tests comportementaux.Le jour de l'expérience, les souris ont effectué des tests comportementaux tests après 10 min [21] accoutumance après connexion La puissance du laser bleu (470 nm) était de 10 mW mm−2 mesurée à l'extrémité de la fibre optique La stimulation lumineuse était délivrée à 50 Hz par impulsions de 20 ms pour périodes de 1 min.Les souris du groupe témoin ont subi la même procédure et ont reçu la même intensité de stimulation au laser.Les souris avec des injections virales mal placées ou des implantations de fibre optique ont été exclues. Les paramètres de stimulation étaient basés à la fois sur les enregistrements électrophysiologiques ex vivo réalisés dans notre laboratoire et sur la littérature publiée [21].

Pour le test d'aversion au lieu conditionné, nous avons utilisé deux chambres distinctes (avec des repères visuels et tactiles différents) reliées par un compartiment neutre. Au jour 1, les souris contrôle et vGAT-Cre ChR2 ont librement exploré l'appareil pendant 20 min. Du jour 2 au jour 4, les souris ont été assignées au hasard à une chambre appariée (l'appariement était contrebalancé) et ont reçu une stimulation lumineuse (fréquence de 50 Hz, durée de 20 ms, délivrée à une durée de 5 min avec des intervalles de 5 min). Deux séances de conditionnement de 20 min ont été menées chaque jour, de sorte que les souris ont reçu une stimulation lumineuse dans la chambre appariée et aucune stimulation lumineuse dans la chambre non appariée (séances du matin et du soir contrebalancées). Au jour 5, les souris ont librement exploré l'appareil en l'absence de stimulation. Les résultats sont exprimés en différence entre le temps passé(s) en chambre jumelée entre le jour 5 (test) et le jour 1 (pré-test).

Dans tous les tests comportementaux, sauf indication contraire, les souris ont été logées dans une salle d'habituation adjacente à la salle expérimentale au moins 1 h avant le début du test. Sauf indication contraire, une solution saline ou CNO ont été injectés 30 min avant les tests comportementaux. Après chaque test, les souris ont été temporairement logées dans une nouvelle cage pour éviter toute interaction sociale avec des souris non testées jusqu'à ce qu'elles aient toutes été testées et finalement retournées dans leurs cages d'origine.

Pour mesurer la congélation induite par un choc électrique, chaque souris a été placée individuellement dans une chambre de test insonorisée contenant un sol constitué d'une grille avec 27 tiges en acier inoxydable (diamètre 4 mm) espacées de 1 cm et reliées à un générateur pour permettre la délivrance de chocs ( Shocker LE 100-26 Panlab Harvard Apparatus Bioseb). Les souris ont été laissées explorer librement l'appareil pendant 3 min, puis ont reçu trois chocs électriques consécutifs au pied (intensité : 0,7 mA, durée : 2 s) avec un intervalle de 58 s entre chaque choc. Les souris sont restées dans la chambre de test 1 min après le dernier choc au pied. Les niveaux d'activité des souris ont été enregistrés grâce à une plaque de capteur de haute précision placée sous la grille du sol (Load cell coupler LE 111 Panlab Harvard Apparatus Bioseb) pour évaluer les variations de poids induites par les mouvements des souris. Chaque test a également été enregistré à l'aide d'une caméra vidéo (Samsung SDP-860) placée au-dessus de l'appareil. Le gel était défini comme une absence totale de mouvement en dehors de la respiration pendant une durée cumulée d'au moins 2 s. Un expérimentateur aveugle aux conditions expérimentales a noté manuellement le comportement de congélation de chaque souris à l'aide des enregistrements vidéo.

La version sous-seuil du paradigme de congélation utilisé avec le système activateur hM3 DREADD a été exécutée sur 2 jours. Le premier jour, les souris ont été placées dans la chambre de test comme décrit ci-dessus et laissées à explorer librement pendant 5 min. Le deuxième jour, les souris ont reçu une injection de solution saline ou de CNO et ont été immédiatement introduites dans la chambre de test. Les souris ont été laissées 1 min pour explorer librement puis ont reçu deux chocs électriques au pied (intensité : 0,7 mA, durée : 2 s ; intervalle de 58 s). Les souris ont ensuite été laissées au repos pendant 15 minutes et le comportement de congélation a été évalué en utilisant la même méthode que celle décrite ci-dessus au cours des 5 dernières minutes du test.

Toutes les souris employées dans la congélation et sa version sous-seuil n'ont pas été réutilisées dans d'autres tests comportementaux.

Pour les manipulations optogénétiques in vivo, les souris ont été placées dans la même boîte de test et laissées libres d'explorer l'appareil pendant 5 min (accoutumance, OFF). Ensuite, ils ont reçu une illumination intracérébrale pendant 1 min (ON), puis 1 min sans illumination (OFF). Aucun choc électrique n'a été délivré. Pour tester la formation de mémoire aversive, les souris ont été réexposées 24 h après au même contexte 24 h. La caméra vidéo a été placée sur le côté de la chambre d'essai pour d'autres analyses comportementales.

Le test O-maze a été utilisé pour mesurer les niveaux d'anxiété. Chaque souris a été placée dans un labyrinthe circulaire composé de deux bras ouverts et de deux bras fermés alternés en quadrants (largeur du couloir de marche : 5 cm, diamètre total : 55 cm, hauteur des murs : 12 cm, élévation au-dessus du sol : 60 cm ) avec une lumière ambiante de 200 lux dans les bras ouverts. Les mouvements des souris ont été enregistrés pendant 5 minutes à l'aide d'une caméra vidéo placée au-dessus du labyrinthe. Un expérimentateur aveugle aux groupes expérimentaux a noté le temps passé dans les bras ouverts.

Le test Open-field a été utilisé pour mesurer l'activité locomotrice. Chaque souris a été placée dans un champ ouvert de 40 × 40 cm avec une lumière ambiante de 200 lux pendant 5 min et laissée explorer librement. Les mouvements des souris ont été enregistrés à l'aide d'une caméra vidéo placée au-dessus de l'appareil. Les déplacements à distance ont été automatiquement analysés à l'aide du logiciel AnyMaze (Stoelting, France).

Le test de Hargreaves a été utilisé pour mesurer la sensibilité à la douleur. Chaque souris a été placée dans un petit compartiment en plastique transparent dans une pièce éclairée par une lumière rouge pendant 30 min d'accoutumance. Ensuite, une source infrarouge rayonnante (intensité : 190 ± 1 mW cm²) a été placée sous la patte arrière des souris et la latence pour retirer la patte a été mesurée. Chaque jour, deux mesures ont été prises pour chaque patte arrière avec au moins 1 min entre chaque mesure et la latence moyenne a été calculée. Le test a été répété pendant 3 jours avec 1 jour d'intervalle entre chaque essai. Seuls les résultats des deux derniers essais ont été analysés par un expérimentateur aveugle. Il convient de noter que les souris qui ont subi le test de Hargreaves ont d'abord été testées dans le labyrinthe O puis en champ ouvert avec un intervalle de 4 jours entre chaque test pour éviter l'effet potentiel de l'exposition pré-CNO.

Les souris ont été anesthésiées (kétamine 150 mg/kg, xylazine 10 mg/kg) et perfusées par voie transcardiaque avec aCSF pour la préparation des tranches. Pour les enregistrements LDTg, des tranches coronales de 250 μm ont été obtenues dans un aCSF glacé (95 % O2/5 % CO2) contenant (en mM) : KCl 2,5, NaH2PO4 1,25, MgSO4 10, CaCl2 2,5, glucose 11, saccharose 234 et NaHCO3 26. Les tranches ont ensuite été incubées dans un LSC contenant (en mM) : NaCl 119, KCl 2,5, NaHPO4 1,25, MgSO4 1,3, CaCl2 2,5, NaHCO3 26 et glucose 11 à 37 °C pendant 15 min, puis conservées à température ambiante. . Les tranches ont été transférées et conservées à 32–34 ° C dans une chambre d'enregistrement superfusée avec 2, 5 ml / min d'aCSF. Des techniques d'enregistrement visualisées de voltage-clamp ou de current-clamp de cellules entières ont été utilisées pour mesurer respectivement les réponses synaptiques ou l'excitabilité, à l'aide d'un microscope droit (Olympus France). Des expériences de pince de courant ont été obtenues en utilisant un Multiclamp 700B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Les signaux ont été collectés et stockés à l'aide d'un convertisseur Digidata 1440 A et du logiciel pCLAMP 10.2 (Molecular Devices, CA). Dans tous les cas, la résistance d'accès a été contrôlée par un pas de -10 mV (0,1 Hz) et les expériences ont été rejetées si la résistance augmentait de plus de 20 %. Solution interne contenue (en mM) : KD-gluconate 135, NaCl 5, MgCl2, HEPES 10, EGTA 0,5, MgATP 2 et NaGTP 0,4. Des pas de courant dépolarisants (0–300 pA) ou hyperpolarisants (0–450 pA) de 800 ms ont été utilisés pour évaluer l'excitabilité et les propriétés membranaires des neurones LDTg et VTA. Pour les enregistrements VTA, des tranches horizontales de 250 µm ont été obtenues comme précédemment et incubées dans aCSF pendant 1 h à 37 ° C avant le début de l'enregistrement.

Pour sonder les connexions synaptiques fonctionnelles au sein du VTA, nous avons injecté à des souris vGATCre un AAV-DIO-ChR2-YFP dans le LDTg et un AAV-hSyn-DIO-mCherry dans le VTA. Cela nous permet d'identifier les neurones VTA GABAergiques exprimant mCherry tout en activant optogénétiquement les terminaux GABAergiques LDTg. Dans un autre lot de souris, nous avons effectué les mêmes injections dans le LDTg et les neurones putatifs VTA DA ont été identifiés sur la base de critères classiques et comme précédemment [20, 27]. Pour identifier sans ambiguïté les neurones glutamatergiques VTA, nous avons injecté à des souris vGluT2Cre un AAV-hSyn-DIO-mCherry dans le VTA et un AAV-hSyn-ChR2-YFP non dépendant du cre dans le LDTg. Nous avons isolé pharmacologiquement la composante GABAergique de la stimulation optogénétique en utilisant des antagonistes des récepteurs glutamatergiques (AP5 50 μM et DNQX 10 μM) et des antagonistes des récepteurs cholinergiques (mécamylamine 10 μM et atropine 1 μM). Enfin, pour enregistrer les neurones VTA → BLA, nous avons injecté à des souris vGATCre un AAV-DIO-ChR2-YFP dans le LDTg et un rétro AAV-hSyn-tdTomato dans le BLA. Les sections horizontales VTA ont été préparées comme précédemment [20]. Des enregistrements de voltage-clamp de cellules entières de neurones marqués par fluorescence dans VTA ont été effectués en utilisant la même solution interne qu'auparavant avec Vm = -40 mV en présence de DNQX pour bloquer les courants AMPA. Les photocourants ont été induits par un éclairage optique (0,1 Hz) avec des impulsions de lumière bleue de 5 ms délivrées par une LED à travers le trajet lumineux objectif. Vingt balayages ont été moyennés hors ligne et l'amplitude de crête a été mesurée pour évaluer la taille du courant évoqué par la lumière. Les courants médiés par les récepteurs GABA-A ont été bloqués à l'aide d'un bain de picrotoxine (Sigma, France) appliqué à une concentration finale de 50 µM.

Dans tous les cas, une analyse hors ligne a été réalisée à l'aide de Clampfit 10.2 (Axon Instruments, USA) et Prism (Graphpad, USA).

Pour réaliser la fixation des cerveaux, les souris ont été anesthésiées à l'aide d'un mélange de kétamine (150 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) puis ont subi une perfusion transcardiaque avec un tampon phosphate froid (PB 0,1 M Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7,4) suivie d'une paraformaldéhyde (PFA 4%, dilué dans PB 0,1 M). Les cerveaux ont été laissés à 4 ° C dans du PFA à 4 % pendant la nuit, puis coupés en tranches flottantes de 40 µm. Des sections ont été utilisées pour évaluer l'emplacement correct de l'injection virale stéréotaxique pour chaque animal et l'implantation de la canule pour des expériences optogénétiques in vivo.

Pour le marquage cFos, des coupes de cerveau contenant le noyau accumbens, l'amygdale ou le septum latéral ont été incubées (30 min) dans du PBS-BT (PBS 0,5 % BSA, 0,1 % Triton X-100) avec 10 % de sérum de chèvre normal (NGS). Les coupes ont ensuite été incubées (4 ° C) dans du PBS-BT, 1% NGS, avec un anti-cFos primaire (1: 1000, Abcam anti-lapin 1: 1000, Cat Ab190289) pendant 36 h. Les coupes ont été rincées dans du PBS et incubées (2 h) dans de l'anticorps secondaire de chèvre anti-lapin Alexa488 (1:1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA; anticorps secondaire de chèvre anti-lapin Alexa488 de chat (1:1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA) ; Cat. DI-1488-1.5) dans du PBS-BT, 1 % de NGS. Les sections ont été rincées avec du PBS et incubées 5 min avec du DAPI avant d'être montées avec du Mowiol. Les images pour la quantification des cellules positives pour cFos ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal TCS SP5 (Leica Microsystems). Un expérimentateur aveugle au traitement a compté manuellement à l'aide d'ImageJ. Le comptage a été effectué sur deux sections de cerveau adjacentes et les deux hémisphères pour chaque région analysée. Une valeur moyenne a été moyennée pour chaque souris et tracée pour chaque condition expérimentale (c.-à-d. Contrôle ou ChR2) sous forme de cellules cFos+/mm2.

Nous avons effectué comme précédemment publié [28, 29]. En bref, les chirurgies stéréotaxiques pour les expériences d'électrophysiologie ont été réalisées sous anesthésie à 1,0–1,5 % d'isoflurane (dans 50 % d'air/50 % d'O2 ; 1 L/min). Une micropipette en verre remplie d'une solution de bleu ciel de pontamine à 2 % dans de l'acétate de sodium à 0,5 % a été abaissée dans la VTA (−3,16 mm/bregma, 0,5 mm/ligne médiane, 3,5–4,5 mm/surface cérébrale) [25]. Les potentiels extracellulaires ont été enregistrés avec un amplificateur et un filtre Axoclamp-2B (300 Hz/0,5 Hz) [30]. Les pointes ont été collectées en ligne (CED 1401, SPIKE 2 ; Cambridge Electronic Design ; Royaume-Uni). Les neurones dopaminergiques VTA ont été identifiés selon des caractéristiques électrophysiologiques bien établies [31, 32], qui comprenaient les éléments suivants (i) un potentiel d'action avec ≥ 1,1 ms (mesuré du début du potentiel d'action au creux négatif), (ii) spontané cadence de tir (≤10 Hz) (iii) schémas de tir spontanés simples et en rafale composés de 2 à 10 pointes in vivo. Le début d'un burst était défini par un intervalle interspike inférieur à 80 msec et la fin du burst par un intervalle interspike supérieur à 160 ms [33]. Les neurones putatifs VTA GABA ont été identifiés selon des critères électrophysiologiques bien établis (i) un potentiel d'action <1 ms; (ii) La limite VTA a été définie à 100 µm dorsale par rapport au premier neurone VTA DA [33, 34, 35, 36]. Plusieurs paramètres de déclenchement et d'éclatement des neurones dopaminergiques VTA ont été analysés sur une période de 100 s : la distribution de probabilité cumulée du taux de déclenchement et les graphiques à barres avec la moyenne ± SEM, le taux d'éclatement, le pourcentage de pointes en rafale (% SIB). La fréquence de déclenchement des neurones GABA a été analysée sur une période de 100 s. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM.

La fréquence cardiaque a été enregistrée à l'aide de l'oxymètre non invasif MouseOx Pulse (Starr Life Sciences). En bref, les souris ont été rasées autour du cou 24 h avant les enregistrements. Le jour de l'enregistrement, des souris individuelles ont été anesthésiées et maintenues sous 1,0 à 1,5 % d'isoflurane (dans 50 % d'air/50 % d'O2 ; 1 L/min). Le collier et le système ont été configurés conformément aux instructions du fabricant, et des fibres optiques ont été connectées à la tête pour stimuler les terminaux LDTg GABA dans le VTA. Après avoir obtenu une ligne de base de 10 min, 3 protocoles de photostimulation ont été délivrés à 50 Hz pendant 1 min, séparés de 2 min. La fréquence cardiaque a été acquise à une fréquence d'échantillonnage de 5 Hz et analysée à l'aide d'Excel. Les écarts de fréquence cardiaque par rapport à la ligne de base ont été calculés en construisant un score z de la trace entière en utilisant la moyenne et l'écart-type. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM.

Les données ont été analysées à l'aide de Prism (GraphPad, États-Unis). La normalité de la distribution a d'abord été testée à l'aide d'un test de Kolmogorov-Smirnov. En fonction du nombre de groupes et des résultats du test de normalité, les groupes ont ensuite été comparés à l'aide d'un test t de Student, de l'U de Mann-Whitney, ou d'analyses de variance à deux voies suivies d'un test de Sidak post hoc. Les données dans les figures sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. La signification statistique a été conventionnellement établie à *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001.

Pour évaluer l'implication du LDTg dans le traitement de la congélation, nous avons utilisé une approche chimiogénétique pour faire taire à distance les neurones LDTg avant l'administration de chocs électriques au pied. Des souris C57BL / 6J de type sauvage ont été injectées dans le LDTg avec DREADD inhibiteur (AAV-hSyn-hM4D-mCherry), ci-après appelées souris LDTghM4 (Fig. 1a, panneau de gauche). Comme le montre le tableau d'activité, la délivrance d'un choc au pied a entraîné une diminution de l'activité locomotrice et une augmentation du temps passé dans les postures de blocage (Fig. 1a, panneau du milieu). La quantification de la congélation chez les souris traitées avec une solution saline a montré une augmentation progressive de ce comportement après chaque choc au pied. En revanche, le silence des neurones LDTg a engendré un déplacement vers le bas prononcé et significatif de la courbe de réponse au gel (Fig. 1a, panneau de droite). Cette réduction de la congélation n'a pas été causée par des changements dans l'activité locomotrice, les niveaux d'anxiété ou la sensibilité à la douleur puisque les souris LDTghM4 traitées avec une solution saline et CNO ont montré des réponses similaires dans le champ ouvert, le labyrinthe O élevé et le test de Hargreaves (Fig. 1b, c, d respectivement). Il est important de noter que la réduction de la congélation n'a pas altéré la formation de la mémoire aversive puisque la réexposition au même contexte 24 h après (jour 2) a produit des réponses de congélation conditionnée comparables dans les deux groupes (Fig. S1). Ces résultats démontrent que l'activité dans les neurones LDTg est nécessaire pour la manifestation du gel de la peur mais pas pour la formation de la mémoire d'un événement aversif.

a Panneau de gauche : des souris de type sauvage ont reçu une injection d'AAV-hsyn-hM4-mCherry dans le LDTg. L'image microscopique, opposée à l'anatomie coronale du LDTg de référence [25], montre une fluorescence rouge au bon site d'injection. Trois semaines plus tard, les souris LDTghM4 ont reçu une injection de solution saline ou de CNO 30 min avant d'être exposées à trois chocs électriques au pied. Panneau du milieu : traces représentatives montrant l'activité des souris pendant le test. Panneau de droite : les réponses de congélation aux chocs électriques du pied sont diminuées chez les souris traitées avec CNO par rapport à la solution saline. Les points représentent le pourcentage moyen ± SEM du temps passé à geler pendant les intervalles de temps suivants : 0 à 3 min, 3 à 4 min, 4 à 5 min et 5 à 6 min. Traitement d'interaction × chocs F (3, 111) = 10,12 ; ANOVA bidirectionnelle à mesures répétées suivie du test de comparaison de Sidak, ***P < 0,001). b L'activité locomotrice en plein champ n'a pas été affectée par l'inhibition du LDTg (P = 0,1072, test t). c Les niveaux d'anxiété n'ont pas été affectés dans le test du labyrinthe en O (P = 0,3741, test t). d La sensibilité à la douleur n'a pas été affectée dans le test de Hargreaves (P = 0,7339, test t). e Des souris de type sauvage ont reçu une injection d'AAV-hsyn-DIO-hM4-mCherry dans LDTg et de CAV-2-CRE dans VTA. Le silence chimiogénétique des projections de LDTg vers VTA réduit le gel. Traitement d'interaction × chocs F (3, 63) = 11,56 ; ANOVA bidirectionnelle à mesures répétées suivie du test de comparaison de Sidak, ***P < 0,001). f L'hyperactivation des projections LDTg vers VTA augmente le gel. Mêmes injections que "e" sauf que hM4 (couplé au Gi, inhibiteur) a été remplacé par hM3 (couplé au Gq, excitateur). Les souris n'ont reçu que deux chocs et leur réaction de congélation a été mesurée 10 min après le dernier choc, pendant 5 min. Pourcentage de temps passé par les souris à congeler (*** P < 0,001, test de Mann-Whitney).

Pour démêler les circuits qui relient LDTg et congélation, nous avons effectué des manipulations chimiogénétiques spécifiques à la projection des projections LDTg vers le gris périaqueducal ventrolatéral (vlPAG) et l'amygdale centrale (CeA), deux régions classiquement liées au contrôle des réponses de congélation [11, 37 ]. Nous avons donc injecté un CAV-2-Cre rétrograde dans le vlPAG ou le CeA et un DREADD inhibiteur dépendant du Cre (AAV-hSyn-DIO-hM4D-mCherry) dans le LDTg pour manipuler indépendamment les projections LDTg → vlPAG ou LDTg → CeA. Nous avons validé cette approche par immunohistofluorescence en observant des neurones mCherry-positifs dans le LDTg et des fibres rouges dans le CeA et le vlPAG (Fig. S2a, b respectivement). Le silence des projections LDTg → vlPAG ou LDTg → CeA n'a pas modifié la réponse de congélation qui était similaire chez les souris recevant une solution saline ou CNO (Fig. S2a, b respectivement). Ensuite, compte tenu de l'intérêt croissant du VTA pour le traitement de l'aversion [38, 39], et des projections denses issues du LDTg [40,41,42,43], nous avons émis l'hypothèse que cette voie pourrait être impliquée dans les comportements de blocage. En effet, l'extinction des projections LDTg → VTA a déclenché un décalage significatif vers le bas de la réponse de congélation (Fig. 1e), ressemblant aux résultats obtenus avec l'extinction complète de LDTg (Fig. 1a). Compte tenu de ce résultat, nous avons émis l'hypothèse que l'activation de cette voie peut exacerber les réactions de peur à un léger défi aversif. Ainsi, nous avons utilisé le DREADD excitateur (AAV-hSyn-DIO-hM3D-mCherry) afin de stimuler les projections LDTg → VTA tout en exposant les souris à seulement deux chocs de pied. Les souris ayant reçu une injection de CNO ont présenté une forte réponse de congélation indiquant qu'un défi de stress léger a amorcé les projections LDTg → VTA (Fig. 1f). Ces résultats soulignent la spécificité des circuits LDTg discrets au traitement aversif des chocs électriques.

Pour évaluer quels types de cellules LDTg sont impliqués dans la régulation de la réponse de congélation, nous avons individuellement réduit au silence chaque population neuronale. Nous avons donc injecté un AAV-hSyn-DIO-hM4-mCherry dépendant de Cre dans des lignées de souris transgéniques vGlut2-Cre, ChAT-Cre ou vGAT-Cre, permettant la manipulation sélective des neurones glutamates, cholinergiques ou GABAergiques respectivement. La réponse de peur induite par les chocs électriques chez les souris LDTgGluT-hM4 et LDTgChAT-hM4 traitées au CNO était comparable à celle des témoins traités avec une solution saline (Fig. 2a, b, respectivement). À l'opposé, la congélation a été nettement réduite chez les souris LDTgGABA-hM4 injectées par CNO (figure 2c, panneau de droite), ce qui met en évidence un rôle clé de la transmission GABAergique LDTg dans les réponses de congélation provoquées par un choc électrique.

a Le silence des neurones LDTg glutamatergiques n'altère pas la congélation. Les souris vGluT2-cre ont reçu une injection d'AAV-hsyn-DIO-hM4-mCherry dans LDTg puis ont subi un paradigme de congélation ; l'image de microscopie montre l'expression de mCherry au site d'injection. Pourcentage de temps que les souris ont passé à geler sur chaque intervalle, identique à la Fig. 1 (traitement d'interaction × chocs F (3, 78) = 0, 4895; mesures répétées ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaison de Sidak, P = 0, 6906). b Le silence des neurones LDTg cholinergiques n'altère pas la congélation. Comme ci-dessus, sauf que les souris étaient ChAT-cre (traitement d'interaction × chocs F (3, 87) = 0,4895 ; mesures répétées ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaison de Sidak, P = 0,6117). c Le silence des neurones GABAergiques LDTg réduit le gel. Identique à ci-dessus, sauf que les souris étaient vGAT-cre (traitement d'interaction × chocs F (3, 114) = 5, 646 ; ANOVA bidirectionnelle à mesures répétées suivie du test de comparaison de Sidak, ** P < 0, 01 ; *** P < 0, 001).

Les résultats précédents ont montré que le silence indépendant des neurones GABAergiques LDTg ou des projections LDTg → VTA est suffisant pour atténuer la réponse de congélation provoquée. Pour tester si les neurones LDTg GABA se projetant sur le VTA peuvent jouer un rôle clé dans ce processus, nous avons ensuite manipulé le LDTg d'une manière spécifique au neurotransmetteur et à la projection en utilisant une double stratégie intersectionnelle. Nous avons d'abord injecté dans la VTA de souris vGAT-Cre un AAV-DIO-flp rétrograde qui permet l'expression de la flippase (flp) de manière Cre-dépendante (c'est-à-dire dans les neurones GABAergiques LDTg→VTA). Ensuite, un DREADD inhibiteur dépendant de la flippase (AAV-hSyn-FRT-hM4-mCherry) a été injecté dans le LDTg. Alors que les souris LDTgGABA → VTA-hM4 traitées avec une solution saline présentaient une réponse de congélation normale, les souris traitées par CNO ont démontré un déplacement significatif vers le bas de la courbe de congélation (Fig. 3a). Cela fournit une preuve solide du rôle régulateur clé de cette projection GABAergique sur la réaction de peur.

a Faire taire les projections GABAergiques LDTg sur VTA réduit le gel. Panneau de gauche : les souris vGAT-cre ont reçu des injections d'AAV-hsyn-FRT-hM4-mCherry dans LDTg et de DIO-flp rétrograde dans VTA, puis ont suivi le même protocole que la Fig. 1 : les images de microscopie montrent des corps cellulaires exprimant mCherry (site d'injection) et fibres en VTA. Panneau du milieu : traces représentatives montrant l'activité des souris pendant le test. Panneau de droite : Pourcentage de temps passé par les souris à geler sur chaque intervalle. Traitement d'interaction × chocs F (3, 90) = 3,088 ; mesures répétées ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaison de Sidak, ** P < 0,01). b Les projections GABAergiques LDTg à VTA sont sensibilisées par le stress aigu. Panneau de gauche : des souris vGAT-cre ont reçu une injection d'AAV-FLEX-tdTomato rétrograde dans VTA, puis ont reçu soit 3 chocs (stressés), soit aucun choc (naïfs). Panneau du milieu à gauche : images de microscopie de cellules GABAergiques projetées sur VTA dans LDTg avec lumière de transmission (en haut) ou émettant une fluorescence rouge (en bas). Panneau du milieu droit : la tension représentative trace les réponses à une injection de courant de 40 pA pour chaque condition. Panneau de droite : profil d'excitabilité des neurones GABAergiques LDTg se projetant sur VTA chez des souris témoins ou stressées. Les tracés illustrent la fréquence du potentiel d'action après l'augmentation des étapes d'injection de courant. Traitement d'interaction × courant F (4, 144) = 1,866) ; Facteur de traitement F (1, 36) = 5,082 ; ANOVA bidirectionnelle à mesures répétées suivie du test de comparaison de Sidak, *P < 0,05).

L'exposition aux chocs aversifs du pied peut-elle altérer les propriétés cellulaires des neurones GABAergiques LDTg→VTA afin de favoriser les réponses de peur ? Nous avons effectué des enregistrements patch-clamp de cellules entières ex vivo dans des neurones GABAergiques LDTg → VTA marqués viralement. Pour cela, des souris vGAT-Cre ont été injectées dans le VTA avec un AAV-FLEX-tdTomato rétrograde (Fig. 3b). Les souris ont été soumises à 3 décharges électriques consécutives au pied, comme décrit pour les tests comportementaux, et enregistrées immédiatement après. Les souris témoins ont été exposées à la chambre sans recevoir de chocs au pied. L'exposition aux chocs du pied a déclenché une excitabilité accrue des neurones GABAergiques LDTg → VTA, mise en évidence par une fréquence de décharge plus élevée aux injections de courant dépolarisant par rapport aux souris non choquées (Fig. 3b, panneau de droite). Il est important de noter que cette adaptation ne s'est accompagnée d'aucun effet significatif sur les propriétés de la membrane passive de la cellule, telles que la résistance de la membrane, la capacité de la membrane ou le potentiel de membrane au repos (Fig. S3a, b, c). Pour tester si les chocs électriques pouvaient modifier l'activité d'autres types de cellules LDTg, nous avons appliqué la même procédure aux souris ChAT-Cre et vGluT2-Cre et enregistré les neurones cholinergiques et glutamatergiques LDTg → VTA. Contrairement à ce que nous avons observé pour la projection des neurones LDTg GABA, les chocs électriques n'ont pas réussi à modifier le profil d'excitabilité des neurones cholinergiques et glutamatergiques se projetant vers le VTA (Fig. 5a supplémentaire). Cependant, les neurones projetants GABAergiques LDTg ne ciblent pas uniquement le VTA. Par conséquent, nous avons testé pour la dernière fois si les chocs électriques pouvaient altérer la fonction des neurones GABAergiques indépendamment des régions cérébrales ciblées. Pour cela, des souris vGATCre ont été injectées dans le vlPAG avec un AAV-FLEX-tdTomato rétrograde. Alors que nous avons constaté une sensibilité accrue des neurones GABAergiques LDTg → VTA, le profil d'excitabilité des neurones GABAergiques LDTg → vlPAG est resté inchangé (Fig. 5b supplémentaire). Ainsi, les chocs du pied affectent l'activité d'une voie LDTg GABAergique discrète.

Nos données recueillies jusqu'à présent indiquent que les chocs électriques déclenchent le gel en amorçant les neurones LDTg GABAergic LDTg→VTA. Afin de tester si la congélation pouvait être induite sans expérience aversive, nous avons utilisé une stimulation optogénétique sélective chez des souris au comportement libre. Nous avons injecté un AAV-hsyn-DIO-hChR2-YFP dépendant de Cre dans le LDTg de souris vGAT-Cre et implanté bilatéralement des fibres optiques au-dessus du VTA. La stimulation lumineuse de ChR2 exprimée sur les terminaux GABAergiques LDTg dans le VTA était suffisante pour induire un gel significatif en l'absence de tout stimulus aversif (Fig. 4a). Les souris ont cessé de geler une fois la stimulation désactivée, ce qui indique un processus cellulaire dynamique. Fait important, lorsque les souris ont été réexposées au même contexte 24 h après en l'absence de stimulation lumineuse, aucune congélation conditionnée n'a été observée (Fig. S6a supplémentaire). De plus, nous avons évalué si l'appariement de la stimulation lumineuse dans un contexte défini pouvait déclencher une aversion conditionnée pour les lieux. Trois appariements quotidiens ont été effectués et les souris ont été testées en l'absence de stimulation lumineuse. Il convient de noter que la distance parcourue par les souris ChR2 dans la chambre non appariée était plus élevée que dans la chambre appariée, comme prévu, où la stimulation lumineuse induisait l'immobilité (Fig. 6b supplémentaire). Néanmoins, les souris témoins et ChR2 ont passé un temps similaire dans la chambre appariée pendant les sessions de pré-test et de test (Fig. 4b). Cela indique que l'activation des terminaux GABAergiques LDTg dans le VTA ne produit pas de souvenirs aversifs.

a L'activation optogénétique in vivo des terminaux GABAergiques LDTg au sein du VTA induit une congélation spontanée. Panneau de gauche : des souris vGAT-cre ont reçu une injection d'AAV-hsyn-DIO-hChR2-YFP (ChR2) ou d'AAV-hsyn-DIO-YFP (contrôle) dans LDTg et ont été implantées avec des fibres optiques au-dessus du VTA ; les images de microscopie montrent une fluorescence verte au site d'injection et l'expression de YFP au site d'injection et des fibres exprimant YFP avec des traces de fibres optiques au site d'implantation dans le VTA. Panneau du milieu : Chronologie expérimentale. Panneau de droite : pourcentage de temps passé par les souris à congeler représenté par la moyenne ± SEM sur les intervalles suivants (groupe d'interaction × lumière F (2, 30) = 4,166 ; mesures répétées ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaison de Sidak, *** P < 0,001 ). b Les souris témoins et ChR2 ont reçu une stimulation lumineuse dans le compartiment apparié et aucune stimulation lumineuse du côté non apparié. Après 3 appariements de chaque côté, les souris ont été autorisées à explorer librement l'appareil de conditionnement. L'activation optogénétique in vivo des terminaux GABAergiques LDTg n'a pas réussi à induire l'aversion pour le lieu (t31 = 0,1606, P = 0,8735). c En utilisant la surveillance télémétrique de la fréquence cardiaque chez les souris anesthésiées, la stimulation lumineuse chez les souris ChR2 a provoqué une bradycardie qui n'a pas été observée chez les animaux témoins lorsque le laser était allumé (t7 = 1,128, P = 0,2966 contrôle ; t12 = 5,191, P < 0,001 ChR2).

Pour différencier si la stimulation optogénétique a provoqué un gel inconditionnel ou un arrêt purement moteur, nous avons effectué des mesures télémétriques de la fréquence cardiaque. Cela a été fait chez des souris anesthésiées pour éviter des changements confondants de la fonction cardiaque et de l'activité physique. La stimulation lumineuse chez les souris ChR2 a entraîné une décélération significative de la fréquence cardiaque (c'est-à-dire une bradycardie), qui n'a pas été observée chez les souris témoins (Fig. 4c). Dans l'ensemble, cette expérience optogénétique imite deux caractéristiques de la congélation inconditionnée, à savoir l'immobilité et la bradycardie. Néanmoins, étant donné que cette intervention ne déclenche pas de souvenirs de peur et que le gel est la somme de différentes réponses physiologiques, y compris l'arrêt de l'activité motrice, nous supposons que ce recrutement de circuit artificiel peut ne pas récapituler complètement les réponses émotionnelles aux stimuli menaçants.

Bien que certaines études aient impliqué le VTA dans la formation de réponses de gel conditionné [44, 45], son rôle dans le gel immédiat inconditionné à la menace ainsi que ses cibles de sortie sont inconnus. Pour comprendre les circuits médiant la réponse de congélation LDTg GABA, nous avons utilisé la stimulation optogénétique des fibres LDTg GABA sur le VTA comme auparavant, et les souris ont été sacrifiées 90 min après la stimulation lumineuse pour effectuer une cartographie cérébrale de l'expression de cFos (Fig. 5a). Nous avons limité nos analyses à deux structures cérébrales connues pour jouer un rôle majeur dans la congélation, l'amygdale [11] et le septum latéral [46]. En tant que cible majeure du VTA et compte tenu de son rôle dans les réponses motrices, nous avons également analysé la réactivité du noyau accumbens (NAc). L'activation des terminaux LDTg GABA dans le VTA a provoqué une activation frappante à la fois dans l'amygdale et le septum latéral, mais pas dans le NAc (Fig. 5b, c et Supplémentaire Fig. 7a, b respectivement).

a Les souris témoins et vGAT-Cre ChR2 ont été sacrifiées 90 min après la stimulation lumineuse, comme illustré dans la chronologie expérimentale (panneau de gauche). Les neurones cFos-positifs ont été comptés dans (b) l'amygdale basolatérale et centrale (BLA et CeA respectivement), (c) la partie dorsale et ventrale du septum latéral (LSD et LSV respectivement). d Chez les souris WT, le silence chimiogénétique des projections VTA vers le BLA (traitement d'interaction × chocs F (3, 51) = 3,604 ; mesures répétées ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaison de Sidak, ** P <0,01), réduit le gel. e Le silence chimiogénétique des projections VTA vers le LS ne modifie pas le comportement de congélation (traitement d'interaction × chocs F (3, 66) = 0,3606 ; mesures répétées ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaison de Sidak, P = 0,7817). *P < 0,05 ; **P < 0,01.

À la lumière de ces résultats, nous avons ensuite testé si la modulation des projections VTA → BLA ou VTA → LS affecterait les réponses de congélation. En utilisant une stratégie virale intersectionnelle, nous avons exprimé un DREADD inhibiteur dans les neurones VTA → BLA (Fig. 5d) ou dans les neurones VTA → LS (Fig. 5e) et avons exposé des souris à des chocs électriques au pied. Une diminution significative du gel n'a été observée que lors de la suppression des projections VTA → BLA, mais pas de la voie VTA → LS (Fig. 5d, e respectivement). Ces résultats indiquent la spécificité des cibles VTA discrètes dans la réponse de congélation.

Les neurones GABAergiques LDTg modulent-ils directement les neurones projetant VTA→BLA ou empiètent-ils sur les micro-circuits VTA ? Pour tester cette hypothèse, nous avons sondé la connectivité fonctionnelle entre cette entrée inhibitrice LDTg et les trois types de cellules VTA (c'est-à-dire les neurones GABA, DA et Glu) ainsi que les neurones projetant VTA comme décrit dans Méthodes. Suite à la photostimulation des terminaux LDTg, nous avons trouvé 24% de cellules (7/29) connectées aux neurones projetant VTA → BLA (Fig. 8a supplémentaire). À l'opposé, 91% des cellules VTA GABA (20/22) ont reçu des entrées GABA du LDTg (Fig. 8b supplémentaire). Ces courants sortants ont été bloqués par la picrotoxine, ce qui indique que cette réponse s'est faite via les récepteurs GABA-A (Fig. 8f supplémentaire). De plus, les neurones GABAergiques LDTg ont établi des contacts fonctionnels avec 95 % des neurones VTA DA putatifs (19/20). Au lieu de cela, seuls 33% des neurones VTA Glu (7/21) ont reçu des entrées GABA du LDTg (Fig. 6d supplémentaire). Parmi les cellules connectées, l'amplitude des courants post-synaptiques inhibiteurs optiques (oIPSC) était plus grande dans les neurones VTA GABA et DA par rapport aux cellules VTA Glu ou aux neurones projetant VTA → BLA (Fig. 6e supplémentaire). Ce premier ensemble de données indique une connectivité fonctionnelle plus prononcée avec les micro-circuits VTA par rapport à ceux en saillie, avec une préférence pour les neurones DA et GABA VTA.

Les résultats de l'analyse de la connectivité suggèrent que le silence des neurones GABAergiques LDTg → VTA devrait moduler préférentiellement l'activité des neurones VTA GABAergiques ou DA. Pour tester cette possibilité et avoir une vision plus complète du contrôle du LDTg sur la fonction VTA, nous avons effectué des enregistrements in vivo chez des animaux anesthésiés tout en faisant taire les projections GABAergiques LDTg → VTA (Fig. 6a). Chez les souris traitées avec une solution saline, les neurones putatifs GABAergiques VTA présentaient un schéma d'activité de déclenchement classique (Fig. 6b) similaire aux rapports précédents [34,35,36]. En revanche, les souris traitées au CNO présentaient un fort déplacement vers la gauche de la distribution du taux de déclenchement des neurones VTA GABA putatifs, reflétant une diminution marquée de l'activité (Fig. 6b). Pour déterminer si l'extinction de la voie GABAergique LDTg → VTA avait un impact plus large sur l'homéostasie VTA, nous avons en outre enregistré in vivo l'activité des neurones VTA DA. La distribution de la vitesse de déclenchement (Fig. 6c), l'activité d'éclatement et les quatre principaux modes de déclenchement des neurones VTA DA [47] ne différaient pas entre les groupes traités avec une solution saline et CNO (Fig. 9 supplémentaire).

a Des enregistrements in vivo ont été effectués dans le VTA de souris LDTgGABA → VTA-hM4 anesthésiées et l'activité des neurones putatifs VTA GABA ou DA a été analysée lors de l'administration systémique de solution saline ou de CNO. La distribution de probabilité cumulative du taux de déclenchement, ainsi que la fréquence de déclenchement (encart) sont présentées pour les neurones putatifs VTA GABA (b) et VTA DA (c). Des traces représentatives pour chaque condition expérimentale sont présentées. Le silence des entrées LDTg GABAergiques vers VTA diminue sélectivement l'activité des neurones VTA GABA sans altérer le déclenchement de VTA DA. **P < 0,01 Test de Mann–Whitney. d Les souris vGATCre ont reçu une injection d'AAV-hSyn-FRT-hM4-mCherry dans le VTA et de rétro AAV-DIO-Flp dans le BLA, puis ont subi un paradigme de congélation. L'image de microscopie montre l'expression de mCherry au site d'injection de VTA. L'inactivation sélective des neurones GABAergiques VTA → BLA a diminué les réponses de congélation (traitement par interaction × chocs F (3, 45) = 4, 947; mesures répétées ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaison de Sidak, ** P <0, 01.

Les neurones VTA GABA peuvent être des neurones à longue portée ou ils pourraient moduler la fonction VTA via une connectivité locale [34, 35, 48, 49, 50]. Pour tenter de résoudre ce problème, nous avons cherché à identifier la nature du neurotransmetteur transmettant à l'amygdale les informations liées au gel. Nous avons donc réduit au silence les neurones DA, Glu et GABA VTA → BLA d'une manière spécifique à la projection et aux neurotransmetteurs tout en soumettant des souris à des chocs électriques au pied pour provoquer la congélation. Seul le silence des neurones GABAergiques VTA → BLA, mais pas DA ou Glu, a diminué le gel (Fig. 6d, Fig. 10a, b supplémentaires, respectivement).

Dans l'ensemble, cet ensemble de données relie une entrée inhibitrice du LDTg à la fonction VTA GABA et fournit la preuve d'une réponse coordonnée du macro-circuit LDTg-VTA-amygdale lors du traitement aversif (Fig. 11 supplémentaire).

Alors que de nombreuses régions du cerveau ont été identifiées pour soutenir les réponses de congélation, le rôle que les sites modulateurs fournissent à cet échafaudage câblé n'est pas connu. Nos résultats fournissent un nouveau cadre pour comprendre comment les expériences aversives déclenchent des changements cellulaires rapides conduisant finalement à des comportements défensifs. Nous montrons ici que l'activité des apports LDTg GABAergiques au VTA est nécessaire à la manifestation de comportements de congélation en réponse à un danger imminent. La stimulation optogénétique de cette projection est suffisante pour favoriser la congélation en l'absence de menace et le recrutement de substrats d'amygdale. Notre étude démontre un rôle non découvert de cette voie dans les comportements défensifs adaptatifs face à la menace, ce qui fournit de nouvelles informations sur les circuits d'adaptation au stress.

Le réseau défensif du cerveau comprend plusieurs zones corticales et sous-corticales interconnectées essentielles à la détection et au traitement des menaces afin de déclencher en temps opportun des réponses défensives [37, 51, 52]. Des études d'imagerie fonctionnelle chez l'homme et des dissections moléculaires, cellulaires et de circuit étendues chez des rongeurs ont positionné l'amygdale, le cortex gris périaqueducal et préfrontal comme principaux actionneurs du contrôle des réponses de peur, qui incluent le gel. Alors qu'un grand nombre de preuves fournit une base solide pour les macro-circuits et les circuits locaux régissant les réponses de congélation conditionnée [11], une compréhension détaillée des mécanismes cellulaires et de la séquence d'événements provoquant un comportement de congélation inconditionné fait toujours défaut. Ceci est très pertinent puisque les symptômes et la pathogenèse des troubles liés à la menace reposent sur des réponses de peur apprises et innées [10, 53]. Dans notre étude, nous démontrons que les chocs électriques du pied déclenchent une augmentation immédiate de l'excitabilité des neurones inhibiteurs LDTg projetant vers le VTA. Le silence de cette projection spécifique a un impact sélectif sur la fonction des neurones VTA GABAergiques, sans altérer le déclenchement des cellules VTA DA. De plus, nous avons disséqué les sorties VTA et observé que le silence des projections GABAergiques VTA vers l'amygdale atténue les réponses de congélation inconditionnées aux chocs du pied. Dans une étude récente, l'inhibition optogénétique sélective des terminaux VTA DA dans l'amygdale a altéré l'acquisition de souvenirs aversifs mais n'a pas eu d'impact sur la congélation inconditionnée aux chocs du pied [54]. Cela suggère que différentes populations de neurotransmetteurs VTA à amygdale contribuent à la congélation inconditionnée et conditionnée.

Soutenant un rôle du VTA dans les réponses défensives, deux rapports récents ont lié le VTA GABA et les neurones glutamatergiques au comportement défensif inné [48, 55]. En effet, l'exposition à une odeur de prédateur ou à un stimulus imminent a provoqué une activation transitoire des neurones à glutamate VTA associée à des comportements d'échappement [55]. En outre, l'apparition de comportements d'échappement évoqués imminents était corrélée aux transitoires de Ca2+ dans les neurones VTA GABA [48]. Conformément à notre étude, les auteurs ont rapporté que la stimulation optogénétique directe de cette population neuronale globale produisait un gel suivi d'un comportement de fuite vers le nid. Cela révèle clairement un rôle émergent pour le VTA dans les comportements défensifs d'évasion. Pourtant, bien qu'il ait été démontré que les neurones VTA réagissent aux chocs du pied [34], leur implication dans l'obtention de réponses de peur rapides reste à découvrir. Ici, nous avons élargi le rôle de VTA dans les réponses défensives en montrant le déclenchement du gel en modulant uniquement un apport de GABA de la région pontique. Les études portant sur le rôle du VTA dans la valence positive et négative se sont de loin concentrées sur le rôle des neurones VTA DA. Ici, dans les expériences que nous avons menées, nous n'avons pas pu impliquer cette population neuronale, mais nous avons cependant identifié un rôle pour les neurones GABAergiques VTA à longue portée. Cela suggère que, de la même manière que les neurones VTA DA, les neurones GABAergiques à longue portée sont susceptibles d'apparaître comme, au moins en partie, une population neuronale séparée calculant des stimuli environnementaux et des demandes internes distincts, afin de piloter différentes facettes de réponses comportementales allant de la modulation de la morphine propriétés gratifiantes, à l'apprentissage associatif et au gel inconditionnel (présente étude) [49, 56, 57].

Globalement, dans ces macro- et micro-circuits de comportements défensifs cérébraux que nous avons révélés, un modèle putatif serait que les chocs électriques activent les neurones GABAergiques LDTg pour produire une désinhibition des neurones VTA → BLA via la modulation des neurones VTA locaux, putativement GABA [50] .

Pour naviguer dans des environnements complexes et en évolution rapide, les mammifères doivent adapter leurs comportements pour accéder aux ressources vitales tout en évitant les situations néfastes. Ces réponses comportementales sont finement réglées par des adaptations cellulaires rapides et durables face à des défis gratifiants et/ou aversifs [58]. La dérégulation de cet équilibre homéostatique conduit à des choix inappropriés et augmente le risque de développer des pathologies psychiatriques [59]. Historiquement, l'axe LDTg-VTA a été fortement lié au traitement et au renforcement des récompenses [60, 61]. Le LDTg est un modulateur important de l'activité de déclenchement de la dopamine VTA et par conséquent de la libération de dopamine dans le cerveau antérieur [20, 62, 63]. Des études pharmacologiques et lésionnelles ont mis en évidence son rôle clé dans l'attribution d'une valeur de récompense aux stimuli et dans la médiation de plusieurs adaptations cellulaires et comportementales aux substances addictives telles que la cocaïne et la nicotine [64]. Les manipulations spécifiques à la projection ont révélé sa contribution aux comportements motivés par l'appétit et gratifiants [16, 43], avec une contribution distincte des projections LDTg cholinergiques et glutamatergiques à ces processus [42]. En effet, la stimulation optogénétique sélective dans la VTA des terminaux glutamatergiques ou cholinergiques LDTg est gratifiante, reflétée par le nombre de temps passés et d'entrées dans une chambre couplée à un stimulus [42]. Des preuves récentes indiquent une implication partielle des entrées GABAergiques dans le VTA dans le rétablissement des comportements de recherche de cocaïne [65]. Malgré ces preuves solides de l'implication de l'axe LDTg-VTA dans le traitement des stimuli positifs, notre présent travail remet en question ce point de vue accepté et démontre une implication causale des entrées inhibitrices LDTg au VTA dans le traitement des défis aversifs immédiats. Nos résultats sont étayés par des preuves montrant que la manipulation optogénétique des interneurones LDTg locaux a un impact sur la peur innée induite par les signaux olfactifs [21]. Cela est susceptible d'affecter les sorties LDTg et de moduler l'activité cible en aval, y compris l'axe LDTg-VTA identifié ici. De plus, nos travaux antérieurs ont démontré que la suractivation des entrées cholinergiques LDTg dans les neurones dopaminergiques VTA suite à une agression sociale déclenchait l'apparition de symptômes de type dépressif [20]. Plus récemment, il a été démontré qu'une molécule trophique dérivée des neurones, la neuréguline-1, était augmentée dans le LDTg suite à un stress de défaite sociale chronique et favorisait des comportements de type dépressif en empiétant sur l'activité des neurones VTA DA [66]. Enfin, l'exposition in utero aux hormones de stress glucocorticoïdes induit des déficits motivationnels, qui peuvent être contrecarrés en modulant les projections LDTg-VTA [67]. Au total, cela suggère que des stimuli environnementaux saillants, gratifiants ou aversifs, recruteraient des populations indépendantes de neurones LDTg, et que la polarisation précoce des réseaux positifs et négatifs était une simplification excessive [68]. Ainsi, les neurones LDTg cholinergiques/glutamatergiques et GABAergiques pourraient coder des états motivationnels complémentaires, favorisant l'approche ou la défense, respectivement, via des projections vers le VTA. Les réponses d'approche et de défense nécessitent l'implication coordonnée des centres moteurs. En particulier, le noyau pédonculopontin (PPN), un centre étroitement lié dans le tronc cérébral, envoie des projections ascendantes à la plupart des noyaux des ganglions de la base, notamment la substantia nigra (SN), contrôlant les réponses motrices [23]. Par exemple, l'activation optogénétique des terminaux cholinergiques PPN dans le SN augmente la locomotion [17]. Un récent rapport bioRxiv montre que les neurones GABAergiques PPN font des synapses sur les neurones SN DA, et que leur activation altère la locomotion exploratoire et arrête l'initiation du mouvement, mais ne produit pas de réponses de congélation [69]. Dans l'ensemble, des projections GABAergiques distinctes du LDTg et du PPN vers le VTA et le SN, respectivement, sont susceptibles de transmettre des signaux complémentaires entraînant la peur et les réponses motrices. Des travaux futurs sont nécessaires pour comprendre un rôle potentiel de la voie GABAergique PPN → SN en réponse à des stimuli aversifs tels que des chocs au pied et une diaphonie putative entre ces projections parallèles du tronc cérébral.

La découverte de régions modulatrices comme celle décrite ici est primordiale pour comprendre les réponses naturelles aux stimuli de menace. Il est important de noter que la voie identifiée ici était limitée à l'induction d'un gel inconditionné et ne produisait pas de formation de mémoire aversive. De plus, la compréhension des adaptations synaptiques et cellulaires sur ces circuits pourrait nous aider à comprendre les mécanismes sous-jacents contribuant aux symptômes de conditions pathologiques. Les études futures devront identifier les actionneurs moléculaires à l'origine de ces (mal)adaptations des circuits afin de les cibler avec des médicaments pharmacologiques classiques. Alternativement, de futures approches thérapeutiques impliquant des techniques de modulation cérébrale pourraient être en mesure de tirer parti des résultats actuels.

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Nous remercions EJ Kremer et la Plateforme de Vectorologie de Montpellier pour avoir fourni CAV-2-Cre. Nous remercions Jean-Charles Paterna et Melanie Rauch, ainsi que l'installation Zurich Vector Core, pour avoir fourni plusieurs virus dépendants de la flippase. Nous remercions le Dr Massimo Mantegazza d'avoir fourni des souris vGAT-Cre. Nous remercions tout le personnel des animaleries pour leur soutien technique.

Ce travail a été soutenu par le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), l'Université Côte d'Azur, le Labex Signalife, la Fédération pour la Recherche sur le Cerveau et Rotary—Espoir en Tête, la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20180339159) et Agence Nationale de la Recherche (ANR-20-CE37-0017) à JB. LB est titulaire d'un doctorat. bourse de la FRM ainsi qu'un doctorat de quatrième année. bourse de la FRM (FDT201904007874). TC est titulaire d'un doctorat de quatrième année. bourse de la FRM (FDT202106012968). LR est titulaire d'un doctorat. bourse de la FRM.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Loïc Broussot, Thomas Contesse.

Ces auteurs ont dirigé conjointement ce travail : Sebastian P. Fernandez, Jacques Barik.

Université Côte d’Azur, Nice, France

Loïc Broussot, Thomas Contesse, Renan Costa-Campos, Léa Royon, Hugo Fofo, Sebastian P. Fernandez & Jacques Barik

CNRS UMR7275, Institut de Pharmacologie Moléculaire & Cellulaire, Valbonne, France

Loïc Broussot, Thomas Contesse, Renan Costa-Campos, Léa Royon, Hugo Fofo, Thomas Lorivel, Sebastian P. Fernandez & Jacques Barik

CNRS, IMN, UMR 5293, Université de Bordeaux, Bordeaux, France

Christelle Glangetas & François Georges

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LB, TC et LR ont réalisé des expériences comportementales. LB, TC et HF ont effectué une microscopie. SPF et RCC ont effectué des enregistrements ex vivo. CG et FG ont réalisé des enregistrements électrophysiologiques in vivo. TL a fourni des supports techniques pour les analyses comportementales. LB, SPF et JB ont conçu le projet et rédigé l'article. Tous les auteurs ont fourni des commentaires sur la rédaction de l'article.

Correspondance à Sebastian P. Fernandez ou Jacques Barik.

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Broussot, L., Contesse, T., Costa-Campos, R. et al. Une voie GABAergique non canonique vers le VTA favorise la congélation inconditionnée. Mol Psychiatry 27, 4905–4917 (2022). https://doi.org/10.1038/s41380-022-01765-7

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Reçu : 31 mai 2021

Révisé : 09 août 2022

Accepté : 22 août 2022

Publié: 20 septembre 2022

Date d'émission : décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41380-022-01765-7

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