Sous-systèmes de dopamine qui suivent les états internes | Groupe de cordons de raccordement Jilin

Nature volume 608, pages 374–380 (2022)Citer cet article

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La nourriture et l'eau sont gratifiantes en partie parce qu'elles satisfont nos besoins internes1,2. Les neurones dopaminergiques de l'aire tegmentale ventrale (VTA) sont activés par les récompenses gustatives3,4,5, mais on ne sait pas comment les animaux apprennent à associer ces signaux oraux aux effets physiologiques retardés de l'ingestion. Ici, nous montrons que les neurones dopaminergiques individuels dans le VTA répondent à la détection de nutriments ou d'eau à des stades spécifiques de l'ingestion. Un sous-ensemble majeur de neurones dopaminergiques suit les changements d'hydratation systémique qui se produisent des dizaines de minutes après que des souris assoiffées aient bu de l'eau, tandis que différents neurones dopaminergiques réagissent aux nutriments dans le tractus gastro-intestinal. Nous montrons que les informations sur l'équilibre hydrique sont transmises au VTA par une voie hypothalamique, puis redirigées vers des circuits en aval qui suivent les étapes orales, gastro-intestinales et post-absorptives de l'ingestion. Pour étudier la fonction de ces signaux, nous avons utilisé un paradigme dans lequel les effets oraux et post-absorptifs d'un fluide peuvent être manipulés indépendamment et séparés dans le temps. Nous montrons que les souris apprennent rapidement à préférer un liquide à un autre en se basant uniquement sur sa capacité de réhydratation et que cet apprentissage post-ingestif est empêché si les neurones dopaminergiques du VTA sont sélectivement réduits au silence après consommation. Ces résultats révèlent que le système dopaminergique du mésencéphale contient des sous-systèmes qui suivent différentes modalités et étapes d'ingestion, sur des échelles de temps allant de quelques secondes à des dizaines de minutes, et que ces informations sont utilisées pour apprendre les conséquences de l'ingestion.

Les animaux doivent décider quoi manger et boire. Cela représente un défi car la valeur nutritionnelle d'une source de nourriture peut ne pas être évidente à partir de son apparence extérieure et les conséquences de son ingestion ne sont pas immédiatement apparentes. Au contraire, les animaux doivent apprendre par l'expérience ingestive les valeurs d'aliments et de liquides spécifiques - s'ils valent la peine de faire des efforts pour les obtenir et s'ils doivent être consommés s'ils sont rencontrés6,7,8. Par exemple, de nombreux animaux obtiennent la majeure partie de leur eau de la nourriture9,10,11,12,13,14,15, et sont donc susceptibles d'apprendre par rétroaction post-ingestive quelles sources de nourriture se réhydratent.

De nombreux aspects de l'apprentissage des récompenses impliquent des neurones dopaminergiques (DA) dans la zone tegmentale ventrale VTA16,17,18,19,20,21 (neurones VTA-DA). En réponse au goût de la nourriture3,4 ou de l'eau4,5, les neurones VTA-DA libèrent une bouffée de dopamine qui confère de la valeur aux signaux associés. Cependant, le goût des aliments et de l'eau sont eux-mêmes des indices qui prédisent la satisfaction ultérieure d'un besoin interne (comme la réhydratation), et leur valeur peut changer à mesure que les animaux apprennent les effets post-ingestifs d'aliments et de liquides spécifiques1,8,22. Cela soulève la question de savoir comment les nutriments et les fluides internes, qui sont les renforçateurs finaux du comportement, sont eux-mêmes représentés dans le système dopaminergique et utilisés pour conduire l'apprentissage.

Pour étudier comment les neurones DA réagissent aux changements internes de l'équilibre hydrique, nous avons enregistré leur activité avant et après la consommation d'eau. Les souris ont été équipées pour l'imagerie microendoscopique de la dynamique du calcium dans les neurones VTA-DA (définis par l'expression de DAT-cre; Fig. 1a), privées d'eau pendant la nuit, puis ont eu un accès illimité à l'eau pendant 5 min. Les souris ont bu avec voracité (données étendues Fig. 1j) et, comme prévu, de nombreux neurones DA ont été activés de manière transitoire d'une manière verrouillée dans le temps au léchage4,5 (22 % ; données étendues Fig. 1b et tableaux de données étendus 1 et 2). Cependant, nous avons également détecté une deuxième vague inattendue d'activation des neurones DA qui a émergé après un délai de 10, 1 ± 0, 6 min depuis le début de la consommation d'alcool (Fig. 1b – e et Extended Data Fig. 1c – i). Cette activation retardée a recruté de nombreux neurones DA (39 %), impliquait des augmentations de la fluorescence de base et des rafales phasiques, et n'était pas liée au léchage (la bouteille d'eau avait disparu). Au lieu de cela, il reflétait l'évolution temporelle rapportée de l'absorption d'eau dans le sang23,24,25,26, suggérant que la réhydratation systémique elle-même déclenche l'activation retardée de nombreux neurones DA.

a, Image représentative du placement de la lentille GRIN et des neurones VTA-DA exprimant GCaMP6. b, Cartes de réglage des réponses des neurones DA à partir du même champ de vision pendant et après avoir bu de l'eau. c, Exemple de traces de dynamique du calcium dans cinq neurones représentatifs pendant et après la consommation d'eau. d, Réponses neuronales individuelles à la consommation d'eau, à la perfusion intragastrique (IG) d'eau (1,2 ml) et à l'injection intrapéritonéale (IP) d'eau (1,2 ml) ou de solution saline hypertonique (3 M NaCl, 0,12 ml). e, score z pondéré en fonction de la population (calculé comme la fraction de neurones activés ou inhibés multipliée par leur changement d'activité noté z) pour chacun des stimuli présentés. Les pourcentages de neurones activés (rouge) et inhibés (bleu) sont indiqués au-dessus et au-dessous de chaque graphique à barres. La « post-ingestion » est de 0 à 20 min après la fin de la consommation d'eau ou de NaCl 0,3 M au rythme de chacun ; « après perfusion IG » est de 0 à 20 min après la fin de la perfusion intragastrique (1,2 ml) d'eau ou de NaCl 0,3 M ; 'après injection IP' est de 0 à 30 min après injection intrapéritonéale d'eau (1,2 ml), de NaCl (3 M, 0,12 ml), d'isoprotérénol (100 mg kg−1) ou de polyéthylène glycol (PEG) (40%, 0,4 ml ). f, en haut, évolution temporelle de l'activation puis retour à la ligne de base des neurones VTA-DA individuels après perfusion intragastrique d'eau (1,2 ml). En bas, trace moyenne. Les souris appartiennent à une cohorte distincte de celles utilisées en d. g, Traces d'activité moyenne des neurones (de d) activés par injection intrapéritonéale d'eau (rouge) et inhibés par injection intrapéritonéale de NaCl (bleu), avec des changements simultanés d'osmolalité sanguine tracés ci-dessous. NS, P > 0,05 ; **P < 0,01, ***P < 0,001. Les données sont moyennes ± sem Les statistiques sont présentées dans le tableau de données étendu 2.

Pour tester si cette réponse retardée nécessite une réhydratation, nous avons donné aux souris accès à une solution hypertonique (NaCl 300 mM) que les souris naïves boiront, mais qui finira par se déshydrater27. La consommation de ce liquide a provoqué une activation transitoire des neurones DA pendant la consommation d'alcool (Extended Data Fig. 1b, k) mais n'a pas entraîné d'augmentation retardée de l'activité de la dopamine (Fig. 1e), malgré des niveaux similaires de consommation totale (Extended Data Fig. 1j) . Il convient de noter qu'une petite population de neurones a également été inhibée, mais l'ampleur de cette inhibition était la même après la consommation d'eau ou de solution saline hypertonique (Fig. 1e).

Pour tester si la réhydratation est suffisante pour l'activation des neurones DA, nous avons équipé des souris de cathéters intragastriques pour une infusion directe de liquide dans l'estomac28. L'infusion d'eau29 (1,2 ml sur 12 min) a entraîné une activation retardée de nombreux neurones enregistrés (Fig. 1d, e, Extended Data Fig. 1m, n et Extended Data Fig. 2). Cela s'est produit 14 ± 1 min après le début de la perfusion (variant légèrement avec la vitesse de perfusion; données étendues Fig. 1o) et a persisté pendant 30 ± 0,7 min avant de revenir progressivement à la ligne de base (Fig. 1f). Le pourcentage de neurones activés et l'ampleur de leur activation étaient similaires après une consommation d'alcool à son rythme et une perfusion intragastrique (Fig. 1e). Notamment, cette activation n'a pas été accompagnée de changements brutaux dans le mouvement (Extended Data Fig. 1p), une réponse plus faible a été observée si les souris n'étaient pas privées d'eau au préalable (Extended Data Fig. 1q), et une inhibition nette a été observée si hypertonique ( 300 mM NaCl) une solution saline a été infusée à la place (Fig. 1e), indiquant que la réhydratation est nécessaire et suffisante pour la réponse du neurone DA.

La réhydratation peut provoquer des changements dans l'osmolalité, le volume et la pression du sang, qui influencent tous la soif. Nous avons donc manipulé indépendamment ces signaux pour déterminer lesquels sont responsables de l'activation des neurones DA suite à l'ingestion d'eau. Des injections intrapéritonéales d'eau et de solution saline hypertonique ont entraîné l'activation et l'inhibition, respectivement, de nombreux neurones DA (Fig. 1d, e), et l'évolution temporelle de ces réponses des neurones DA a suivi les changements simultanés de l'osmolalité sanguine (Fig. 1g). L'injection de mannitol a inhibé les neurones DA de la même manière qu'une solution saline hypertonique équiosmotique (indiquant que la réponse reflète les changements d'osmolalité et non les changements de concentration de sodium; Données étendues Fig. 1r), et la réponse des neurones DA s'est produite en quelques secondes lorsque le sel a été administré par voie intraveineuse (indiquant qu'il reflète un changement systémique ; Données étendues Fig. 1s–t). En revanche, les injections de polyéthylène glycol ou d'isoprotérénol, qui diminuent respectivement le volume sanguin et la pression artérielle27,30,31, ont provoqué des réponses neuronales DA beaucoup plus faibles (Fig. 1e). Ainsi, de nombreux neurones VTA-DA suivent spécifiquement et de manière bidirectionnelle les changements dans l'osmolalité systémique, révélant un rôle inattendu de l'équilibre hydrique dans le contrôle de l'activité du système dopaminergique.

Nous avons ensuite comparé la façon dont les neurones DA réagissent à l'eau et aux nutriments. Nous avons d'abord confirmé que la consommation du régime liquide Ensure par des souris affamées entraînait une activation transitoire de nombreux neurones DA verrouillés dans le temps au léchage3,4 (Extended Data Fig. 3a,b). Pour isoler proprement les signaux post-ingestifs, nous avons enregistré les réponses dopaminergiques à la perfusion d'Ensure directement dans l'estomac (en une quantité (1,2 kcal) qui se rapproche d'un repas de taille moyenne32 et inhibe les neurones AgRP favorisant la faim33). Cela a révélé que des sous-ensembles distincts de neurones DA sont activés pendant la perfusion de nutriments (10 % des neurones DA, lorsque les nutriments pénètrent dans le tractus gastro-intestinal) et par la suite (13 % des neurones DA ; lorsque la plupart des nutriments sont absorbés dans le sang ; Données étendues Fig. 3c– e). Cela indique que, par rapport à l'eau, les nutriments activent plus de neurones DA dans le tractus gastro-intestinal, mais moins après absorption dans la circulation sanguine (Données étendues Figs. 1u et 3c, d).

Nous avons ensuite comparé la façon dont les neurones DA individuels répondent à ces différents stimuli en alignant leurs réponses d'une expérience à l'autre (Fig. 2a). Pour boire, les neurones individuels ont répondu de manière cohérente aux modifications de l'équilibre hydrique, quelle que soit la méthode d'administration des fluides. Par exemple, la plupart des neurones activés après une injection intrapéritonéale d'eau ou une consommation d'eau à son rythme étaient également activés après une perfusion intragastrique d'eau (Fig. 2e et Extended Data Fig. 4e). Les neurones activés après injection intrapéritonéale d'eau ont été inhibés en conséquence par injection de solution saline hypertonique (Fig. 2f). De même, pour les nutriments, la réponse des neurones individuels après une perfusion intragastrique d'Ensure était corrélée à leur réponse après une injection ou une perfusion de glucose (Extended Data Fig. 4f, h). Contrairement à ces réponses cohérentes aux changements systémiques, il n'y avait aucune corrélation dans les réponses neuronales individuelles à travers les étapes de l'ingestion (par exemple, pendant ou après le léchage ; données étendues Fig. 4a – d) ou entre l'eau et les nutriments au même stade (Fig. 2b–d). Cela révèle qu'il existe des sous-ensembles de neurones VTA-DA qui sont réglés pour suivre les nutriments ou les fluides à un stade spécifique de l'ingestion.

a, Cartes de neurones VTA-DA individuels suivis au cours des jours expérimentaux pendant l'imagerie. b, Exemple de traces de neurones répondant spécifiquement à une perfusion intragastrique (1,2 ml) d'Ensure ou d'eau. c, à gauche, proportion de neurones activés lors de la perfusion intragastrique d'Ensure et d'eau. À droite, les neurones individuels ne montrent aucune corrélation dans leur réponse lors de la perfusion intragastrique d'eau par rapport à Ensure. d, A gauche, proportion de neurones activés de 0 à 20 min après la fin de la perfusion intragastrique d'eau ou d'Ensure. À droite, les neurones individuels ne montrent aucune corrélation dans leur réponse après une perfusion intragastrique d'eau par rapport à Ensure. e, à gauche, exemples de traces montrant des neurones activés après une perfusion intragastrique et une injection intrapéritonéale d'eau (1,2 ml). Au milieu, proportion de neurones activés par l'eau intrapéritonéale et intragastrique. À droite, la réponse des neurones individuels à l'injection d'eau intrapéritonéale est positivement corrélée avec leur réponse à l'injection d'eau intragastrique. f, à gauche, exemples de traces montrant des neurones qui affichent des schémas d'activité opposés après injection d'eau intrapéritonéale (1,2 ml) et injection de solution saline hypertonique (3 M NaCl, 0,12 ml). Au milieu, proportion de neurones activés par l'eau intrapéritonéale et inhibés par le sérum physiologique intrapéritonéal. À droite, les réponses des neurones individuels à l'eau intrapéritonéale et à la solution saline intrapéritonéale sont négativement corrélées. Les données sont moyennes ± sem Les statistiques sont présentées dans le tableau de données étendu 2.

Nous avons ensuite étudié comment les informations sur l'équilibre hydrique sont transmises au VTA. Nous avons d'abord considéré l'hypothalamus latéral (LH), qui est impliqué dans le comportement ingestif34,35 et envoie une projection GABAergique dense (productrice d'acide γ-aminobutyrique) au VTA36 (qui peut activer les neurones VTA-DA indirectement par l'inhibition des neurones GABAergiques intermédiaires dans VTA37 (neurones VTA-GABA)). Nous avons préparé des souris pour l'imagerie des neurones GABAergiques dans la LH (neurones LH-GABA) et la perfusion intragastrique, puis nous avons enregistré comment ces neurones réagissent aux modifications de l'équilibre hydrique. Semblables aux neurones VTA-DA, de nombreux neurones LH-GABA ont été activés après une infusion d'eau (données étendues Fig. 5a, b) et inhibés par injection de solution saline hypertonique (données étendues Fig. 5c). Pour tester si le sous-ensemble de neurones LH-GABA qui se projettent spécifiquement vers le VTA affichent ces réponses, nous avons utilisé une stratégie de traçage rétrograde pour imager la dynamique du calcium dans les neurones LH-GABA → VTA, révélant que ces neurones sont également fortement activés après une perfusion intragastrique de l'eau (Données étendues Fig. 5d). Ainsi, les neurones LH-GABA → VTA suivent l'équilibre hydrique et sont prêts à relayer cette information au VTA.

Pour tester si ce circuit transmet des informations sur l'équilibre hydrique au VTA (Fig. 3a), nous avons d'abord mesuré comment l'activation des neurones LH-GABA → VTA influence l'activité des neurones VTA-GABA. La stimulation optogénétique des terminaux LH-GABA dans le VTA combinée à l'imagerie simultanée des corps cellulaires des neurones VTA-GABA a révélé que l'activation des neurones LH-GABA → VTA induit une inhibition forte et prolongée dans la majorité des neurones VTA-GABA (Extended Data Fig. 5e) . Ceci suggère que l'activation naturelle des neurones LH-GABA par l'eau serait suffisante pour moduler la dynamique VTA.

a, Un modèle d'une possible voie anatomique reliant les neurones intéroceptifs pour l'eau et les nutriments au VTA. b, à gauche, schéma de l'imagerie microendoscope simultanée des neurones VTA-DA et de l'inhibition chimiogénétique (avec hM4Di) des neurones LH-GABA. À droite, réponses de la population (telles que définies à la Fig. 1) pour les neurones VTA-DA activés (rouge) ou inhibés (bleu) par une solution saline ou CNO, et après infusion d'eau après solution saline ou CNO. c, à gauche, schéma de l'imagerie microendoscope simultanée des neurones VTA-DA et de l'activation chimiogénétique (avec hM3Dq) des neurones de la soif SFO. Milieu, dynamique des neurones VTA-DA individuels en réponse à l'infusion d'eau après injection de solution saline ou de CNO chez des souris rassasiées. À droite, réponses de la population des neurones VTA-DA activés (rouge) ou inhibés (bleu) après perfusion intragastrique. d, Réponses de population de neurones VTA-DA activés (rouge) ou inhibés (bleu) après injection intrapéritonéale d'eau. Déshydraté, déshydraté. Les données sont moyennes ± sem Les statistiques sont présentées dans le tableau de données étendu 2.

Pour tester si les neurones LH-GABA sont nécessaires aux neurones VTA-DA pour suivre les changements dans l'équilibre hydrique, nous avons ciblé le récepteur concepteur inhibiteur exclusivement activé par les médicaments de synthèse (DREADD) hM4Di sur les neurones LH-GABA lors de l'imagerie des neurones VTA-DA. L'infusion d'eau seule a de nouveau provoqué une forte activation de nombreux neurones DA (Fig. 3b). Il convient de noter que le silence des neurones LH-GABA avant la perfusion intragastrique d'eau a spécifiquement bloqué cette réponse ultérieure des neurones VTA-DA (Fig. 3b). Cela suggère que les neurones LH-GABA sont la source du signal qui informe les neurones VTA-DA de l'équilibre hydrique (Fig. 3a).

Les informations sur l'équilibre hydrique pénètrent dans le cerveau par des neurones intéroceptifs dédiés, y compris les neurones glutamatergiques de l'organe sous-fornique (SFO) qui sont directement activés par la déshydratation27, provoquent la soif38,39,40,41,42,43 et sont situés en amont de la LH dans le circuit de la soif40 (Fig. 3a). Pour déterminer si le SFO transmet des informations sur l'équilibre hydrique aux neurones LH et à leurs cibles VTA, nous avons ciblé le DREADD hM3Dq excitateur sur les neurones SFO favorisant la soif et imagé les réponses calciques dans les neurones VTA-DA. L'injection de N-oxyde de clozapine (CNO) a poussé les souris rassasiées à boire voracement, confirmant l'activation des neurones SFO, mais le CNO n'a eu qu'un effet subtil sur l'activité neuronale VTA-DA au départ (en l'absence d'eau; Données étendues Fig. 6a), indiquant que le SFO n'est pas suffisant pour piloter la dynamique de la dopamine VTA. En revanche, CNO a potentialisé l'activation des neurones VTA-DA par l'administration ultérieure d'eau, imitant l'effet de la déshydratation naturelle (Fig. 3c, d et Extended Data Fig. 1q). Semblable au SFO, la stimulation des neurones AgRP favorisant la faim44,45,46 n'a pas affecté l'activité des neurones DA au départ, mais a modulé les réponses post-absorptives aux nutriments internes (imitant l'effet de la privation de nourriture; Données étendues Fig. 6c – f) . Ensemble, cela indique que les neurones SFO et AgRP contrôlent l'ampleur des réponses des neurones DA aux changements pertinents de l'état interne, mais ne transmettent pas directement les informations sur l'hydratation systémique et les nutriments.

Pour tester si cet effet modulateur des neurones SFO sur le VTA est transmis par la LH, nous avons de nouveau ciblé hM3Dq sur les neurones SFO favorisant la soif, puis avons imagé la dynamique du calcium dans les neurones LH-GABA → VTA. La stimulation chimiogénétique des neurones SFO a potentialisé l'activation des neurones LH-GABA par perfusion d'eau intragastrique, similaire à l'effet de la déshydratation naturelle (Extended Data Fig. 6g) et comme observé dans les neurones VTA-DA (Fig. 3c, d). L'activation des neurones SFO seuls a également provoqué une modulation faible mais significative de l'activité des neurones LH-GABA au départ (Extended Data Fig. 6g). Ensemble, ces découvertes révèlent que les neurones SFO modulent les réponses de la dopamine à l'eau, au moins en partie, par des effets sur les neurones LH-GABA en amont (Fig. 3a).

Pour étudier comment les informations sur les fluides et les nutriments sont transmises du VTA aux circuits en aval, nous avons préparé des souris pour l'enregistrement de la perfusion intragastrique et de la photométrie des fibres de la dopamine extracellulaire à l'aide de GRAB-DA5 (Fig. 4a et Extended Data Fig. 7) dans six projections densément innervées. cibles des neurones VTA-DA36 - le cortex préfrontal infralimbique (IL), l'amygdale basolatérale (BLA), le striatum dorsal (DS) et trois subdivisions du noyau accumbens (NAc) (latéral (lat), coque médiale (mSh) et noyau). Nous avons également préparé des souris pour des enregistrements dans le VTA lui-même afin de mesurer la libération locale de dopamine47,48,49. Nous avons ensuite mesuré la libération de dopamine sur ces sept sites (données étendues Fig. 8a) en réponse à un ensemble de stimuli associés à l'ingestion, y compris manger et boire à son rythme ainsi que des perfusions intragastriques de nutriments et de liquides.

a, Schéma montrant la configuration et sept sites d'enregistrement (cercles rouges) pour mesurer la libération de dopamine. b, A gauche, exemple d'enregistrement du mSh montrant la libération de dopamine lors de la phase orale d'ingestion d'eau (30 s après le début du léchage). À droite, libération moyenne de dopamine dans chaque région enregistrée au cours de cette phase orale lors de la consommation d'eau (bleu) et d'Assure (orange). c, à gauche, exemple d'enregistrement de BLA montrant la libération de dopamine pendant la phase gastro-intestinale pour Ensure (12 premières minutes après le début de la perfusion intragastrique). À droite, la libération moyenne de dopamine dans chaque région enregistrée au cours de cette phase gastro-intestinale pendant la perfusion d'eau et d'assurer. d, A gauche, exemple d'enregistrement de VTA montrant la libération de dopamine pendant la phase systémique pour l'eau (12 à 50 min après le début de la perfusion intragastrique). À droite, la libération moyenne de dopamine dans chaque région enregistrée au cours de cette phase systémique après l'eau et la perfusion Assurer. e, à gauche, schéma de l'imagerie spécifique à la projection. Réponses moyennes et moyennes des neurones VTA-DA → BLA et des neurones VTA-DA → mSh lors de la perfusion intragastrique d'eau (phase gastro-intestinale mise en évidence). À droite, réponses moyennes (score z pondéré en fonction de la population) des neurones activés se projetant vers BLA et mSh. *P < 0,05. Les données sont moyennes ± sem Les statistiques sont présentées dans les tableaux de données étendus 2 et 3.

Cela a révélé que la dopamine est libérée à différents sites cérébraux d'une manière qui suit le passage des nutriments et des fluides à travers les étapes de l'ingestion (de la bouche au tractus gastro-intestinal au sang; Fig. 4b – d et Extended Data Table 3). Nous avons constaté que les nutriments et les liquides oraux déclenchaient la libération de dopamine dans de nombreuses régions du cerveau qui était verrouillée dans le temps pour lécher de la nourriture et de l'eau, y compris dans la NAc, comme indiqué précédemment4,5. La détection ultérieure d'eau dans le tractus gastro-intestinal était représentée dans plusieurs zones, mais pas dans la NAc, tandis que les nutriments gastro-intestinaux déclenchaient la libération de dopamine dans la BLA seule (Fig. 4c). Il convient de noter que la libération de dopamine dans la BLA s'est accélérée pendant des dizaines de secondes pendant la consommation d'une manière plus cohérente avec le remplissage gastrique qu'avec la rétroaction oro-sensorielle immédiate (données étendues Fig. 8f). Nous avons confirmé avec une imagerie spécifique à la projection que la libération différentielle de dopamine dans NAc et BLA en réponse aux signaux gastro-intestinaux correspond à la dynamique du calcium du corps cellulaire des neurones VTA-DA qui se projettent vers ces deux zones (Fig. 4e et Extended Data Fig. 8e) .

En plus de ces réponses orales et gastro-intestinales, nous avons observé une troisième étape post-absorptive caractérisée par une libération prolongée de dopamine dans le VTA lui-même (Fig. 4d). Cette libération de dopamine (vraisemblablement somatodendritique47,48,49) s'est progressivement accélérée après une consommation d'eau à son propre rythme ou une perfusion d'eau intragastrique, est restée élevée pendant des dizaines de minutes et a été potentialisée par une privation d'eau préalable (données étendues, Fig. 8c). La libération de dopamine dans VTA a également été observée (mais avec un début plus rapide) après injection intrapéritonéale d'eau (Extended Data Fig. 8d), et l'évolution temporelle de la libération de dopamine par les neurones VTA-DA en réponse à l'eau administrée par ces différentes voies reflétait la dynamique du calcium d'une grande sous-population de neurones VTA-DA (Fig. 1), qui à son tour suivait la réhydratation systémique. En plus de la VTA, nous avons également observé la libération de dopamine dans DS pendant et après la perfusion intragastrique d'eau (Fig. 4c, d et Extended Data Fig. 8b, c, f). Ensemble, ces résultats révèlent que le système dopaminergique est organisé de telle sorte que différentes étapes de l'ingestion déclenchent préférentiellement la libération de dopamine dans des sous-ensembles distincts de cibles en aval.

De nombreux animaux obtiennent leur eau de diverses sources, y compris les aliments9,10,11,12,13,14,15, et doivent donc apprendre quels aliments et liquides se réhydratent grâce à l'expérience ingestive. Nous avons envisagé la possibilité que l'activation des neurones dopaminergiques par réhydratation systémique puisse être impliquée dans ce processus d'apprentissage. Il convient de noter que bien que les récompenses en eau soient largement utilisées pour entraîner les animaux50, les tentatives de contourner la consommation normale et de conduire un comportement opérant avec des fluides intragastriques seuls ont été infructueuses51,52. Cependant, nous avons estimé que les modifications de l'équilibre hydrique pourraient être plus efficaces pour favoriser l'apprentissage des signaux oraux tels que les saveurs, car ces deux modalités sont étroitement couplées lors d'une ingestion normale.

Pour tester cette idée, nous avons développé un système en boucle fermée pour coupler le léchage à l'infusion intragastrique, de sorte que la saveur et la capacité de réhydratation d'une solution ingérée puissent varier indépendamment (Fig. 5a ; inspiré d'études antérieures sur le conditionnement de la saveur des nutriments8,22, 53,54,55,56). Nous avons programmé ce système de telle sorte que chaque coup de langue d'une solution aromatisée déclenche l'infusion intragastrique d'un volume égal de solution saline, et chaque coup de langue d'une solution aromatisée différemment déclenche l'infusion intragastrique d'un volume égal d'eau. Par conséquent, la consommation d'une seule solution est réhydratante, mais cela ne peut pas être initialement anticipé sur la base du goût.

a, Schéma du système en boucle fermée pour l'entraînement aux préférences fluides. Les souris sont hydratées par la consommation d'une solution aromatisée (saveur A) et légèrement déshydratées par une autre (saveur B) via une infusion intragastrique d'eau ou de solution saline déclenchée par le léchage. b, Préférence pour la saveur A avant et après l'entraînement. c, Évolution de la consommation totale le premier et le dernier jour de formation. d, à gauche, fluorescence GRAB-DA dans mSh et BLA lors de la consommation de la solution déshydratante les premier et dernier jours d'entraînement. À droite, tracés récapitulatifs des réponses GRAB-DA déclenchées par le léchage les premier et dernier jours de formation avec chaque solution. e, L'inhibition sélective des neurones VTA-DA pendant l'entraînement après la suppression de l'accès à l'eau (minutes 10 à 60) élimine l'apprentissage des préférences chez les souris exprimant le GtACR, mais pas chez les témoins mCherry. Les données sont moyennes ± sem Les statistiques sont présentées dans le tableau de données étendu 4.

Nous avons d'abord déterminé les préférences au départ en donnant aux souris un test à deux bouteilles avec ces saveurs en l'absence de perfusion intragastrique. Les souris ont ensuite été entraînées en fournissant un accès isolé à chaque solution (qui déclenchait désormais une perfusion intragastrique) pendant trois séances d'une heure sur des jours consécutifs. Après l'entraînement, les souris ont été testées à nouveau avec un test à deux bouteilles en l'absence de perfusion pour mesurer tout changement appris de préférence. Cela a révélé que les souris apprennent à préférer fortement les solutions associées à l'infusion d'eau, comme mesuré par le test à deux bouteilles (Fig. 5b et Extended Data Table 4) et la consommation pendant l'entraînement (Fig. 5c et Extended Data Fig. 9a), qui était accompagnée par des changements dans la libération de dopamine déclenchée par la consommation dans NAc et BLA (Fig. 5d et Extended Data Fig. 10). Cela indique que des changements lents et retardés de l'équilibre hydrique peuvent entraîner un apprentissage robuste et des changements dans la libération de dopamine, lorsqu'ils sont associés à un signal oral approprié.

Pour tester si l'activité des neurones DA est nécessaire à ce processus d'apprentissage, nous avons utilisé l'opsine inhibitrice stGtACR2 pour faire taire les neurones VTA-DA tout au long de l'entraînement, ce qui a bloqué l'acquisition de la préférence des fluides (Extended Data Fig. 9b). Cependant, les neurones VTA-DA sont activés à la fois par des signaux oraux et post-ingestifs (Fig. 1). Pour tester spécifiquement la fonction de l'activité des neurones DA post-ingestion, nous avons modifié le protocole d'entraînement afin que les souris aient accès à chaque fluide pendant seulement 10 min par session d'entraînement (séparant ainsi dans le temps la consommation d'eau de ses effets post-absorption, qui commencent environ 10 min après le début de la consommation) (Extended Data Fig. 1d). Les souris ont appris de manière robuste à préférer la saveur associée à l'infusion d'eau à l'aide de ce nouveau protocole (Extended Data Fig. 9c), qui nous a permis de tester le rôle des signaux post-ingestifs en faisant taire optogénétiquement les neurones VTA-DA uniquement après la suppression de l'accès à l'eau. Le silence des neurones VTA-DA au cours de cette phase post-absorptive était suffisant pour bloquer l'acquisition de la préférence apprise (Fig. 5e). Ceci révèle que l'activation des neurones VTA-DA par hydratation systémique est nécessaire à l'apprentissage des conséquences de l'ingestion de liquide, même lorsque cette activation intervient après l'arrêt de la consommation.

Ici, nous avons montré qu'il existe plusieurs sous-systèmes intégrés au système dopaminergique mésolimbique qui suivent les conséquences internes post-ingestives de l'alimentation et de la boisson. Nous avons constaté que les modifications de l'équilibre hydrique ont des effets particulièrement importants sur la dynamique du calcium des neurones DA, ce qui nous a amenés à étudier comment les signaux d'hydratation sont communiqués au système dopaminergique et utilisés pour l'apprentissage. Cela a révélé que les neurones GABAergiques de la LH transmettent des informations sur l'hydratation systémique au VTA, tandis que les neurones favorisant la soif dans le SFO contrôlent le gain de ce signal. Nous avons en outre montré que la dopamine est libérée dans différents sites en aval en réponse à la détection d'aliments et de liquides à des stades progressifs d'ingestion. Nous avons sondé la fonction de ces signaux à l'aide d'un paradigme comportemental qui dissocie les effets oraux et systémiques des fluides ingérés, ce qui a révélé que la réhydratation post-ingestive seule peut entraîner un apprentissage robuste et que cela nécessite des neurones VTA-DA. Cela expose une logique organisationnelle dans laquelle l'ingestion de nourriture et d'eau et leurs effets ultérieurs sur l'état interne sont représentés de manière différentielle dans le système dopaminergique et utilisés pour l'apprentissage.

Des études antérieures sur le système dopaminergique et les fluides se sont concentrées sur la consommation d'alcool et les réponses aiguës aux signaux de l'eau4,19,57,58. Nous avons examiné les changements dans l'équilibre hydrique sur des échelles de temps plus longues et avons constaté que la déshydratation et la réhydratation systémiques déclenchent l'inhibition et l'activation, respectivement, de nombreux neurones VTA-DA. Ces réponses suivent les modifications de l'osmolalité sanguine, persistent pendant des dizaines de minutes, sont indépendantes de la méthode d'administration de liquide et sont en corrélation avec la libération locale de dopamine dans le VTA. La fonction de la libération de dopamine somatodendritique est mal comprise mais est localisée dans l'espace, contrôlée par des schémas de déclenchement uniques et une machinerie synaptique47,49, et a le potentiel de déclencher l'activité de sous-ensembles et d'entrées de neurones DA spécifiques47,59,60. Ensemble, ces résultats révèlent que les changements dans l'équilibre hydrique modulent non seulement les réponses des neurones DA aux signaux d'eau61, mais modulent également directement le système dans son ensemble.

Contrairement aux fluides, plusieurs études ont rapporté que les nutriments ingérés déclenchent la libération de dopamine dans le striatum62, 63, 64, 65, 66, et nous avons détecté une augmentation subtile de la dopamine dans NAc mSh (mais pas NAc ou DS central ou latéral) après que les nutriments aient été livré à l'estomac (Fig. 4d). Cependant, nous avons découvert de manière inattendue que les nutriments intragastriques déclenchaient le plus haut niveau de libération de dopamine dans la BLA pendant la phase gastro-intestinale et systémique (Fig. 4c, d). Le BLA est bien connu pour le traitement des informations nutritionnelles67 et des travaux antérieurs ont montré que les lésions BLA68 ou la pharmacologie55 peuvent bloquer l'apprentissage des saveurs. Ces résultats donnent la priorité à une enquête plus approfondie sur la voie VTA → BLA pour comprendre comment les signaux nutritionnels internes conduisent à l'apprentissage des aliments.

L'apprentissage des aliments et des liquides nécessite de relier plusieurs échelles de temps de signaux. Le système dopaminergique est bien connu pour son rôle dans l'apprentissage des relations entre les signaux externes et les récompenses gustatives19,20, telles que la vue de l'eau et son goût. Cependant, le goût de l'eau est lui-même un indice qui prédit un changement retardé de l'équilibre hydrique, et si et comment les animaux apprennent de telles relations n'ont pas été clairs. Ici, nous avons montré que les animaux peuvent apprendre à associer les goûts à une réhydratation corporelle retardée, qui active les neurones VTA-DA, et que cette activité retardée est nécessaire à l'apprentissage. Cela identifie une voie clé qui permet aux animaux d'apprendre quels aliments et liquides consommer pour rester hydratés. Une enquête plus approfondie de ce circuit peut révéler des principes sur la façon dont le cerveau comble l'écart entre les signaux transitoires associés à l'ingestion et les effets physiologiques retardés.

Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par l'Université de Californie, San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee, conformément au NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

Les expériences ont utilisé des souris adultes (> 6 semaines) des deux sexes, hébergées dans des installations à température et humidité contrôlées avec un cycle lumière-obscurité de 12 h et un accès ad libitum à l'eau et à la nourriture standard (PicoLab 5053). Nous avons obtenu des souris DAT-ires-cre (B6.SJL-Slc6a3tm1.1(cre)Bkmn, Jackson cat. No. 006660) et Vgat-ires-cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl, Jackson #016962) de Jackson Labs. Souris knock-in Vgat-ires-flp (B6.Cg-Slc32a1tm2.1(flop)Hze) et souris knock-in Npy-ires-flp (B6.Cg-Npytm1.1(flop)Hze) du Allen Institute for Sciences du cerveau. Des souris knock-in DAT-ires-cre ont été croisées avec des souris knock-in Vgat-ires-flp ou avec des souris knock-in Npy-ires-flp pour générer des doubles mutants.

Pour tous les comportements et enregistrements, les souris ont été placées dans des chambres comportementales insonorisées (Coulbourn Habitest Modular System) exclusivement pendant le cycle d'obscurité. Les chambres ont été nettoyées entre les expériences pour éliminer tous les indices olfactifs restants des expériences précédentes. Toutes les souris ont été habituées pendant au moins 1 h à la chambre comportementale (avec un équipement d'enregistrement et un cathéter intragastrique simultanément attachés) avant d'être utilisées pour des expériences les jours suivants. Les souris ont en outre été réhabituées à la chambre comportementale pendant 10 à 20 minutes au début de chaque session de test (au cours de laquelle la LED utilisée pour l'imagerie a été allumée, afin de réduire les artefacts de blanchiment initiaux au début de l'enregistrement).

Pour les expériences de réponse au léchage, les souris étaient soit privées d'eau (pour les expériences utilisant de l'eau ou 300 mM de consommation de NaCl), soit privées de nourriture (pour les expériences utilisant la consommation d'assurer) pendant 24 h avant l'expérience. Les souris ont ensuite eu accès à un lickomètre contenant la solution appropriée (solutions d'eau, d'Ensure ou de NaCl 300 mM) pendant un total de 5 minutes, ce qui a été défini comme commençant par le premier épisode de léchage (pour contrôler le fait que certaines souris avaient une latence plus longue à boire). L'accès a été interrompu en retirant la bouteille de la chambre, en prenant soin d'éviter tout signal olfactif restant (par exemple, en nettoyant les gouttes). Les expériences mesurant les réponses à la consommation de 300 mM de NaCl ont été réalisées uniquement sur des souris naïves, car les animaux peuvent apprendre à éviter les solutions hypertoniques après une seule expérience69. Toutes les souris ont été habituées initialement au lickomètre et à la configuration d'enregistrement en donnant accès à une bouteille contenant de l'eau pendant une heure avec la caméra microendoscope attachée.

Des injections intrapéritonéales ont été réalisées sur le côté droit de la souris. Pour enregistrer les réponses aux injections intrapéritonéales seules, les enregistrements se sont poursuivis pendant 30 minutes après l'injection. Pour enregistrer la modulation de la réponse par l'activation de DREADD, l'injection de CNO a été suivie d'une perfusion intragastrique ou d'une injection intrapéritonéale après 5 min (voir ci-dessous). Nous avons utilisé les doses suivantes comme indiqué dans les légendes des figures : 1,2 ml d'eau, 0,6 ml de glucose à 50 %, 0,12 ml de NaCl 3 M et 1,2 ml de NaCl 154 mM (solution saline isotonique). Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale fictive un jour avant d'être utilisées pour ces expériences pour habituer les souris.

Des injections intraveineuses ont été réalisées en injectant une solution saline hypertonique (100 ul, 1 M NaCl) dans la veine latérale de la queue, tandis que la souris a été maintenue dans un système de retenue sur mesure qui permet une imagerie simultanée. Les souris ont été habituées pendant 30 minutes à la configuration avant le début de l'expérience. Pour enregistrer les réponses aux injections intraveineuses, les enregistrements se sont poursuivis pendant 30 minutes après l'injection. Les animaux n'ont pas été anesthésiés pendant ces expériences.

Les perfusions intragastriques ont été administrées à un débit de 100 ou 200 μl min−1 à l'aide d'une pompe à seringue (Harvard Apparatus 70–2001), pendant 6 ou 12 min (résultant en un volume total perfusé de 0,6 ou 1,2 ml). Des solutions de NaCl (154 ou 300 mM), de glucose (25 %) et d'Ensure ont été préparées en utilisant de l'eau déminéralisée. Nous avons précédemment mesuré la latence pour que les fluides traversent le cathéter intragastrique lui-même à environ 13 s à un débit de perfusion20 de 200 μl min−1. Pour les expériences de perfusion, le cathéter intragastrique a été fixé à la pompe à seringue à l'aide de tubes et d'adaptateurs en plastique (AAD04119, Tygon; LS20, Instech) avant que les souris ne soient placées dans la chambre comportementale.

La déférentation vagale a été réalisée en injectant à des souris préparées pour l'imagerie microendoscopique des neurones VTA-DA (voir la section ci-dessous) 50 mg kg-1 de capsaïcine. Les souris ont été maintenues sous anesthésie avec de l'isoflurane pendant 1 h en commençant immédiatement avant l'injection pour éviter des douleurs inutiles, selon des protocoles précédemment publiés70. L'efficacité de la désafférentation a été déterminée en testant le nombre de lingettes oculaires dans les 15 secondes suivant l'administration oculaire de capsaïcine à 0, 1% (par rapport aux souris ayant subi la même opération de désafférentation mais ayant reçu une injection de solution saline; Données étendues Fig. 5f).

Des cathéters intragastriques ont été installés selon nos protocoles publiés20,24. En bref, des cathéters vétérinaires à accès stérile (C30PU-RGA1439, Instech Labs) ont été fixés à des boutons d'accès vasculaire stérile (VABM1B/22, 22, Instech Labs). Les souris ont été anesthésiées avec de la kétamine-xylazine, le cathéter a été implanté chirurgicalement dans l'estomac avasculaire et le port du bouton d'accès a été fixé au dos de la souris (avec le port vers l'extérieur, c'est-à-dire dorsalement). Un capuchon protecteur en aluminium (VABM1C, Instech Labs) a été placé sur le port pour le protéger entre les expériences. Les souris ont eu une semaine pour récupérer après une chirurgie intragastrique avant le début des expériences.

Les souris ont été préparées pour les enregistrements au microendoscope en utilisant les procédures générales que nous avons rapportées20. En bref, lors de la première intervention chirurgicale, des souris ont reçu une injection d'un virus adéno-associé (AAV) exprimant un GCaMP et une lentille GRIN a été abaissée dans le cerveau. Quatre semaines plus tard, les souris ont subi une deuxième intervention chirurgicale au cours de laquelle une plaque de base (Inscopix 100-000279) a été placée au-dessus de la lentille et fixée avec du ciment adhésif (MetaBond), puis recouverte après la chirurgie d'un couvercle de plaque de base (Inscopix 100-000241). La plupart des animaux ont ensuite subi une troisième intervention chirurgicale pour installer un cathéter intragastrique pour les perfusions de liquide dans l'estomac. Les détails pour chaque cohorte sont ci-dessous.

Des souris DAT-cre (n = 14) ont été préparées pour l'imagerie en injectant AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl ; 7,2 × 1012 copies du génome viral (vg) ml-1 ; Addgene) dans le VTA gauche ( −3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) et installation d'une lentille GRIN (6,1 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004610) à 0,15 mm au-dessus du site d'injection dans la même chirurgie. Lors d'opérations chirurgicales ultérieures, chaque souris a été munie d'une plaque de base puis équipée d'un cathéter intragastrique.

Des souris VGAT-cre (n = 5) ont été préparées pour l'imagerie en injectant AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl ; 7,2 × 1012 vg ml−1 ; Addgene) dans la LH gauche (−1,5 mm AP, +1,0 mm ML, -5,1 mm DV) et installation d'une lentille GRIN (8,3 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004611) 0,15 mm au-dessus du site d'injection dans la même chirurgie. Lors d'opérations chirurgicales ultérieures, chaque souris a été munie d'une plaque de base puis équipée d'un cathéter intragastrique

Des souris VGAT-cre (n = 3) ont été préparées pour l'imagerie en injectant AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m (300 nl ; 2 × 1012 vg ml−1 ; Janelia Vector Core) dans la LH gauche (−1,5 mm AP, +1,0 mm ML, −5,1 mm DV), CAV2-Flx-Flp (300 nl ; 6 × 1012 vg ml−1 ; Plateforme de Vectorologie) dans VTA gauche (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) et installation d'une lentille GRIN (8,3 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004611) à 0,15 mm au-dessus du site d'injection de LH. Dans les chirurgies ultérieures, chaque souris a été munie d'une plaque de base puis équipée d'un cathéter intragastrique.

Des souris VGAT-cre (n = 3) ont été préparées pour l'imagerie en injectant AAV5-hSyn-DIO-ChrimsonR-tdTomato (300 nl ; 4,4 × 1012 vg ml−1 ; Addgene) dans la LH gauche (−1,5 mm AP, +1,0 mm ML, -5,1 mm DV); AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl ; 7,2 × 1012 vg ml−1 ; Addgene) dans le VTA gauche (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) et installation d'une lentille GRIN (6,1 × 0,5 mm ; Inscopix 1050-004610) 0,15 mm au-dessus du site d'injection dans la même chirurgie. Pour stimuler pendant l'enregistrement, une LED de 620 nm a été délivrée via la caméra nVoke 2.0 (puissance de LED de 15 mW mm-2, fréquence d'impulsion de 20 Hz, largeur d'impulsion de 1 ms, cycle de 2 s ON et 3 s OFF).

Des souris DAT-cre :: VGAT-Flp (n = 6) ont été préparées pour l'imagerie en injectant AAVDJ-hSyn-fDIO-hM4Di-mCherry (400 nl; 1,1 × 1013 vg ml−1; Stanford) bilatéralement dans la LH (−1,5 mm AP, ± 1,0 mm ML, −5,1 mm DV); AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl ; 7,2 × 1012 vg ml-1 ; Addgene) dans le VTA gauche (-3,1 mm AP, +0,5 mm ML, -4,5 mm DV) ; et installer une lentille GRIN (6,1 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004610) 0,15 mm au-dessus du site d'injection dans la même chirurgie. Lors d'opérations chirurgicales ultérieures, chaque souris a été munie d'une plaque de base puis équipée d'un cathéter intragastrique.

Des souris DAT-cre (n = 3) ont été préparées pour l'imagerie en injectant AAV2-CamKIIa-HA-hM3Dq-ires-mCitrine (100 nl; 2 × 1012 vg ml-1; UNC Vector Core) dans le SFO (-0,6 mm AP , 0 mm ML, -2,8 mm DV); AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl ; 7,2 × 1012 vg ml-1 ; Addgene) dans le VTA gauche (-3,1 mm AP, +0,5 mm ML, -4,5 mm DV) ; et installer une lentille GRIN (6,1 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004610) 0,15 mm au-dessus du site d'injection dans la même chirurgie. Pour confirmer l'expression fonctionnelle de hM3D, les souris ont reçu une injection de CNO ou de solution saline (100 μl), puis ont eu accès à de l'eau pendant 5 minutes (Extended Data Fig. 6a). Lors d'opérations chirurgicales ultérieures, chaque souris a été munie d'une plaque de base puis équipée d'un cathéter intragastrique

Des souris DAT-cre :: NPY-Flp (n = 3) ont été préparées pour l'imagerie en injectant AAV1-Ef1a-fDIO-hM3Dq-mCherry (200 nl ; 3 × 1012 vg ml−1 ; Stanford) dans l'ARC bilatéralement (−1,75 mm AP, ± 0,2 mm ML, -5,9 mm DV) ; AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl ; 7,2 × 1012 vg ml−1 ; Addgene) dans le VTA gauche (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) et installation d'un GRIN lentille (6,1 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004610) à 0,15 mm au-dessus du site d'injection dans la même chirurgie. Pour confirmer l'expression fonctionnelle de hM3D, les souris ont reçu une injection de CNO ou de solution saline (100 μl) et la consommation d'Ensure a été enregistrée pendant 5 min (Extended Data Fig. 6c). Lors d'opérations chirurgicales ultérieures, chaque souris a été munie d'une plaque de base puis équipée d'un cathéter intragastrique

Des souris VGAT-cre (n = 4) ont été préparées pour l'imagerie en injectant AAV2-CamKIIa-HA-hM3Dq-ires-mCitrine (100 nl; 2 × 1012 vg ml-1; UNC Vector Core) dans le SFO (-0,6 mm AP , 0 mm ML, −2,8 mm DV), AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m (300 nl ; 2 × 1012 vg ml−1 ; Janelia Vector Core) dans la gauche LH (−1,5 mm AP, +1,0 mm ML, − 5,1 mm DV) et CAV2-Flx-Flp (300 nl ; 6 × 1012 vg ml−1 ; Plateforme de Vectorologie) dans VTA gauche (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV). Une lentille GRIN (8,3 × 0,5 mm ; Inscopix 1050-004611) a été implantée à 0,15 mm au-dessus du site d'injection de LH dans la même chirurgie. Lors d'opérations chirurgicales ultérieures, chaque souris a été munie d'une plaque de base puis équipée d'un cathéter intragastrique

Des souris DAT-cre (n = 3) ont été préparées pour l'imagerie en injectant AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m (300 nl ; 2 × 1012 vg ml−1 ; Janelia Vector Core) dans le VTA gauche (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) et CAV2-Flx-Flp (100 nl ; 6 × 1012 vg ml−1 ; Plateforme de Vectorologie) dans NAc mSh gauche (+1,3 mm AP, +0,5 mm ML, −4,4 mm DV) . Une lentille GRIN (6,1 × 0,5 mm ; Inscopix 1050-004610) a été implantée à 0,15 mm au-dessus du site d'injection VTA dans la même chirurgie. Lors d'opérations chirurgicales ultérieures, chaque souris a été munie d'une plaque de base puis équipée d'un cathéter intragastrique

Des souris DAT-cre (n = 3) ont été préparées pour l'imagerie en injectant AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m (300 nl ; 2 × 1012 vg ml−1 ; Janelia Vector Core) dans le VTA gauche (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) et CAV2-Flx-Flp (200 nl ; 6 × 1012 vg ml−1 ; Plateforme de Vectorologie) dans la BLA gauche (−1,8 mm AP, +2,9 mm ML, −4,7 mm DV). Une lentille GRIN (6,1 × 0,5 mm ; Inscopix 1050-004610) a été implantée à 0,15 mm au-dessus du site d'injection VTA dans la même chirurgie. Lors d'opérations chirurgicales ultérieures, chaque souris a été munie d'une plaque de base puis équipée d'un cathéter intragastrique.

Les vidéos de microendoscopie ont été acquises à 8 Hz (puissance LED de 0,6 à 0,8 mW mm −2 455 nm, gain de 8,0, sous-échantillonnage spatial 2 ×) à l'aide du logiciel Inscopix (Data Acquisition Software v. 151; https://support.inscopix.com/support /products/nvista-30-and-nvoke-20/data-acquisition-software-v151). Après l'acquisition, les vidéos ont d'abord été prétraitées, spatialement (facteur de regroupement de 2) et temporellement (facteur de regroupement de 2) sous-échantillonnées, passées à travers un filtre passe-bande spatial (pour éliminer le bruit et les cellules floues) et corrigées en mouvement. à l'aide du logiciel de traitement de données Inscopix (v1.3.1, https://support.inscopix.com/support/products/data-processing-software/inscopix-data-processing-v131). Les vidéos ont été supprimées si un mouvement excessif (plus grand que le diamètre du neurone moyen dans n'importe quelle direction) se produisait et ne pouvait pas être traité par une correction de mouvement supplémentaire. Les traces d'activité des neurones individuels ont ensuite été extraites de ces vidéos à l'aide du pipeline de factorisation matricielle non négative contrainte (CNMF-E) (http://www.github.com/zhoupc/cnmfe) mis en œuvre dans MATLAB. Après la segmentation CNMF-E initiale, les neurones extraits ont été affinés manuellement pour éviter les artefacts de mouvement non corrigés, la duplication de la région d'intérêt et la sur-segmentation des mêmes composants spatiaux. Les neurones ont été retirés si de grands artefacts de blanchiment (qui correspondent à une fonction de décroissance exponentielle définie) se produisaient au cours de la période de référence de 10 minutes. Pour chaque expérience, les traces d'activité des neurones individuels ont été extraites des enregistrements de 3 à 6 souris, puis regroupées pour une analyse ultérieure. Nous pourrions facilement aligner les cellules entre les sessions d'enregistrement séparées de deux semaines. Cela reposait sur un logiciel personnalisé combiné à une vérification manuelle de tous les alignements.

L'accélération de la tête a été acquise à l'aide du logiciel Inscopix (Data Acquisition Software v. 151) à partir de l'accéléromètre 3 axes intégré aux caméras nVoke/nVista, qui a fourni des données d'accélération xyz à une résolution temporelle de 50 Hz.

La consommation de liquide a été surveillée avec un lickomètre capacitif et enregistrée à l'aide du nVista/nVoke (v. 3.0 système nVista ; v. 2.0 système nVoke ; https://support.inscopix.com/support/products/nvista-30/nvista-30) systèmes et logiciels d'acquisition de données (logiciel d'acquisition de données v. 151 ; https://support.inscopix.com/support/products/nvista-30-and-nvoke-20/data-acquisition-software-v151) pendant les expériences d'imagerie au microendoscope.

Des souris de type sauvage (C57BL/6J, Jackson cat. No. 000664) ont été préparées pour des enregistrements de photométrie en injectant AAV9-hSyn-GRAB-DA1h (200 nl ; 1,8×1013 vg ml-1 ; Janelia Vector Core) dans les sites suivants : gauche VTA (n = 10 souris ; -3,1 mm AP, +0,5 mm ML, -4,5 mm DV), BLA (n = 12 souris ; -1,8 mm AP, +2,9 mm ML, -4,7 mm DV), IL PFC (n = 13 souris ; +1,7 mm AP, +0,3 mm ML, -2,85 mm DV), DS (n = 8 souris ; +1,5 mm AP, +1,5 mm ML, -3,5 mm DV) ; NAc mSh (n = 14 souris ; +1,3 mm AP, +0,5 mm ML, -4,4 mm DV), noyau NAc (n = 7 souris ; +1,4 mm AP, +1,0 mm ML, -4,5 mm DV) ou latéral NAc (n = 8 souris ; +1,0 mm AP, +1,75 mm ML, -5,0 mm DV). Dans la même chirurgie, une fibre optique (diamètre intérieur de 0,4 mm sur 3,5, 5,4 ou 6,3 mm de longueur ; lentilles doriques, MFC_400/430-0,48) a été installée à 0,1 mm au-dessus du site d'injection. Après avoir laissé au moins une semaine pour récupérer de la chirurgie intracrânienne, les souris ont ensuite subi une deuxième intervention chirurgicale pour installer un cathéter intragastrique comme décrit ci-dessus.

Pour l'acquisition du signal GRAB-DA, les souris implantées ont été attachées à un câble patch (Doric Lenses, MFP_400/460/900-0.48_2m_FCM-MF2.5). Une LED bleue continue de 6 mW (470 nm) et une LED UV (405 nm) ont servi de sources lumineuses d'excitation. Ces LED ont été pilotées par un hub multicanal (Thorlabs), modulées à 211 Hz et 511 Hz respectivement, et délivrées à un minicube filtré (Doric Lenses, FMC6_AE(400–410)_E1(450–490)_F1(500–540)_E2 (550–580)_ F2(600–680)_S) avant de se connecter via des fibres optiques (lentilles doriques, MFC_400/430-0.48). Les signaux GRAB-DA GFP et les signaux isobestiques UV ont été collectés à travers ces mêmes fibres dans un photorécepteur en silicium femtowatt (Newport, 2151). Les signaux numériques ont été échantillonnés à 1,0173 kHz, démodulés, amplifiés par verrouillage, envoyés via un processeur (RZ5P, Tucker-Davis Technologies) et collectés par Synapse (TDT). Après l'expérience, ces données ont été exportées via le navigateur (TDT) et sous-échantillonnées temporellement dans MATLAB à 4 Hz. Toutes les traces de photométrie tracées dans cet article sont une moyenne de deux traces répétées pour la même souris (effectuées à moins de 2 semaines l'une de l'autre), à l'exception de la consommation de NaCl 300 mM qui ne peut être testée qu'une seule fois lorsque les souris sont naïves. Dans certains cas, les souris ont été retirées de l'étude en raison de problèmes de santé avant de pouvoir être testées avec tous les stimuli, et par conséquent, certaines comparaisons par paires ne sont pas possibles pour toutes les souris de la cohorte.

La consommation de liquide a également été surveillée avec un lickomètre électrique et enregistrée à l'aide du logiciel Synapse (TDT), puis exportée via le navigateur (TDT) et analysée dans MATLAB.

Pour l'enregistrement de la photométrie GRAB-DA pendant l'entraînement aux préférences fluides, l'accès aux solutions aromatisées a été restreint pendant une période de référence de 10 min au début de l'enregistrement (en plus de la période d'acclimatation de 10 à 20 min mentionnée précédemment).

Nous avons préparé des souris pour l'activation ou l'inhibition chimiogénétique in vivo comme décrit ci-dessus. Le CNO (1 mg kg -1, 100 μl) ou le véhicule (DMSO à 0, 6% dans une solution saline) a été administré par injection intrapéritonéale.

Les souris ont été continuellement restreintes en eau en fournissant 1 ml d'eau par jour (en plus de l'eau obtenue pendant les tests et l'entraînement) et ont été retirées de l'étude si leur poids corporel tombait en dessous de 85 % du poids corporel initial. Les souris ont été testées et entraînées à l'aide d'un protocole de dix jours basé sur des procédures similaires pour le conditionnement de la saveur des nutriments22. En bref, la préférence initiale pour les solutions a été déterminée à l'aide d'un test à deux bouteilles au cours des deux premiers jours. La formation s'est déroulée au cours des six jours suivants, après quoi la préférence a été réévaluée. Les souris ont été acclimatées à la chambre comportementale pendant 10 à 20 min avant que les solutions aromatisées ne deviennent accessibles. Un nombre approximativement égal de souris femelles et mâles a été utilisé pour toutes les expériences de formation de préférence fluide. Des cathéters pour perfusion intragastrique ont été attachés aux souris pendant toutes les expériences (y compris les tests à deux flacons). Les souris ont été retirées de la restriction d'eau immédiatement après le protocole d'entraînement de dix jours et ont eu une semaine pour récupérer.

Au cours de la formation, les souris ont reçu un accès isolé à l'une des deux solutions aromatisées, ce qui a déclenché une perfusion intragastrique lorsqu'elle était consommée. Les souris ont été séparées en quatre groupes. Pendant les trois premiers jours de formation, le premier groupe a eu accès pendant 1 h à une solution contenant 0,05 % de Grape Kool-Aid non sucré (Kraft Foods) mélangé à 0,025 % de saccharine. La consommation de cette solution, mesurée à l'aide d'un lickomètre électrique, a déclenché une perfusion intragastrique de 1 µl de NaCl 600 mM. Pendant les trois jours consécutifs suivants, la solution a été remplacée par une solution contenant 0,05 % de kool-aid de citron vert non sucré (Kraft Foods) mélangé à 0,025 % de saccharine, qui a déclenché une infusion intragastrique de 1 μl d'eau lorsqu'elle est consommée. Le deuxième groupe a suivi le même entraînement, mais l'ordre des saveurs a été inversé. Les troisième et quatrième groupes ont suivi les mêmes protocoles que les groupes un et deux respectivement, mais à la place, le raisin était associé à une infusion d'eau et la chaux était associée à une infusion de NaCl 600 mM. En bref, les groupes étaient les suivants. Groupe 1 : raisin → NaCl infusion (jours 1 à 3) ; chaux→infusion d'eau (jours 4–6); groupe 2 : infusion de chaux→eau (jours 1 à 3) ; raisin → perfusion de NaCl (jours 4 à 6) ; groupe 3 : infusion raisin→eau (jours 1 à 3) ; chaux → perfusion de NaCl (jours 4 à 6) ; groupe 4 : infusion chaux→NaCl (jours 1 à 3) ; raisin → infusion d'eau (jours 4–6).

Les préférences initiales et acquises ont été déterminées à l'aide de tests à deux bouteilles sur deux jours consécutifs avant et après l'entraînement (quatre jours au total). Le placement de la solution aromatisée (avant ou arrière de la cage) a été randomisé le premier jour et inversé le deuxième jour du test à deux bouteilles.

Pour les tests à deux bouteilles, les souris ont eu accès pendant 1 h à deux solutions contenant 0,05 % de Kool-Aid non sucré, soit du citron-lime ou du raisin (Kraft Foods), mélangés à 0,025 % de saccharine. La préférence pour la solution de chaux a été calculée à l'aide de la formule (léchages de chaux/léchages totaux). La consommation de liquide a été surveillée avec un lickomètre électrique et enregistrée à l'aide du logiciel Synapse (TDT), puis exportée via le navigateur (TDT) et analysée dans MATLAB.

Pour certaines expériences (Fig. 5e et Extended Data Fig. 9c), l'accès a été accordé pour une durée limitée pendant la formation. Ces expériences ont été réalisées selon le même protocole ci-dessus, mais l'accès à la solution aromatisée a été supprimé 10 min après le premier coup de langue lors de chaque journée d'entraînement.

Pour le silence VTA-DA tout au long de l'entraînement aux préférences liquidiennes (Extended Data Fig. 9b), AAV8-hSyn-DIO-stGtACR2-fRED (400 nl, 7,9 × 1012 vg ml-1; Stanford) ou AAV5-Ef1a-DIO-mCherry (400 nl, 7,3 × 1012 vg ml−1; UNC Vector Core) a été injecté bilatéralement dans le VTA (−3,1 mm AP, ± 0,5 mm ML, −4,5 mm DV) et une fibre optique d'un diamètre intérieur de 200 μm (Thorlabs FT200UMT , CFLC230-10) a été placé à 0,30 mm au-dessus et entre les sites d'injection (-3,1 mm AP, 0 mm ML, -4,2 mm DV) dans la même chirurgie chez des souris DAT-cre (n = 11 souris). Pendant la période de formation, un laser DPSS 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century BL473-100FC) a été contrôlé par le logiciel Graphic State (v.4.2, http://www.coulbourn.com/category_s/363.html) via un Générateur de signal TTL (Coulbourn H03-14) et synchronisé avec la disponibilité des bouteilles. La puissance laser a été mesurée à environ 1 à 2 mW à l'extrémité du câble de raccordement et a été délivrée en continu pendant l'heure expérimentale.

Pour le silence VTA-DA retardé pendant l'entraînement aux préférences hydriques (Fig. 5e), AAV8-hSyn-DIO-stGtACR2-fRED (400 nl, 7,9 × 1012 vg ml-1; Stanford) ou AAV5-Ef1a-DIO-mCherry (400nl, 7,3 × 1012 vg ml−1 ; UNC Vector Core) a été injecté bilatéralement dans le VTA (−3,1 mm AP, ± 0,5 mm ML, −4,5 mm DV), et deux fibres optiques d'un diamètre intérieur de 200 μm (Thorlabs FT200UMT, CFLC230-10) ont été placés à un angle de 100 μm des 2 sites cibles dans la même chirurgie chez des souris DAT-cre (n = 12 souris). Pendant la période de formation, un laser DPSS 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century BL473-100FC) a été allumé 10 minutes après le premier coup de langue pendant chaque journée de formation. Immédiatement avant l'allumage du laser, l'accès à la solution a été supprimé, de sorte que le silence ne se chevauche pas avec la consommation. La puissance laser a été mesurée à environ 1 à 2 mW à l'extrémité du câble de raccordement et a été délivrée en continu pendant le reste de l'heure expérimentale.

Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale (1,2 ml d'eau ou 0,12 ml de NaCl 3 M). Du sang (250 μl) a été prélevé dans des tubes capillaires recouverts d'EDTA (RAM Scientific 07-6011) de la joue droite 5 min avant l'injection et de la joue gauche à un moment précis après l'injection (0 min, 5 min, 10 min, 15 mn, 20 mn, 25 mn ou 30 mn). Le processus de collecte de sang prenait en moyenne 30 s par souris (les échantillons étaient jetés si la collecte prenait plus de 2 min). Le sang a été centrifugé (1 000 g pendant 30 min), et le surnageant a été retiré et de nouveau centrifugé (10 000 g pendant 30 min) pour isoler le plasma. La qualité du plasma a été classée en fonction de la couleur et les échantillons ont été jetés avec une légèreté inférieure à 70 % (voir la couleur #ff6666 pour référence). L'osmolalité plasmatique a été immédiatement mesurée en double pour chaque échantillon à l'aide d'un osmomètre à point de congélation (Fiske Associates 210). La différence entre les osmolalités des deux échantillons a été utilisée pour l'analyse. Les souris ont eu droit à une semaine de récupération entre les échantillons.

Les souris ont été perfusées par voie transcardiaque avec du PBS suivi de formol à 10 %. Des cerveaux entiers ont été disséqués et conservés dans du formol à 10 % pendant une nuit à 4 °C. Le lendemain, les cerveaux ont été transférés dans du saccharose à 30 % pour une cryoprotection pendant la nuit à 4 °C. Des coupes (40 μm) ont été préparées avec un cryostat. Pour visualiser le marquage fluorescent, ces sections ont été montées avec DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech) puis imagées avec le microscope confocal sans coloration. Les images ont subi un traitement minimal à l'aide d'ImageJ (v.1.53e).

Nous avons analysé les données de comportement, les données de photométrie des fibres et les données d'imagerie microendoscope à l'aide de scripts MATLAB personnalisés (v.R2020b, http://www.mathworks.com/products/matlab).

Pour l'analyse d'imagerie au microendoscope, toutes les réponses ont été normalisées à l'aide de la fonction z = (Craw − μ)/σ, où Craw est une sortie du pipeline CNMF-E, μ est la moyenne de Craw pendant la période de référence (10 premières minutes) et σ est l'écart type de Craw au cours de cette même période de référence. Pour l'analyse du potentiel d'action, le taux de pointe déduit (S ; sortie du pipeline CNMF-E) a été utilisé. Pour l'analyse de fluorescence de base, Craw a été soumis à un filtre passe-bas de 1/60 Hz (qui supprime tous les changements se produisant plus rapidement que 1 min).

Pour l'analyse photométrique, toutes les réponses ont été normalisées à l'aide de la fonction : ΔF/F0 = (F − F0)/F0, où F est le signal photométrique brut et F0 est la fluorescence prédite à l'aide du signal obtenu avec une excitation à 405 nm (en utilisant une régression linéaire modèle des deux signaux pendant la période de référence de 10 min ; Données étendues Fig. 7a–c). Pour la présentation des données, les traces tracées ont en outre été sous-échantillonnées à 1 Hz (ceci a été fait pour réduire la taille de chaque graphique).

Pour la quantification de l'activité à différentes échelles de temps d'ingestion, certaines époques ont été définies pour les stades d'ingestion orale, gastro-intestinale et systémique. Ces époques ont été mises à jour après avoir analysé les temps de montée de chaque réponse dans les enregistrements initiaux. Les neurones étaient considérés comme activés au cours de ces époques si leur changement moyen d'activité au cours de l'époque dépassait +1z (et, dans le cas des données étendues Fig. 3c, était supérieur au changement moyen d'activité au cours des autres époques).

Les réponses orales (lécher) ont été définies pour les enregistrements au microendoscope comme le changement moyen d'activité noté z dans les 30 s suivant le début du premier épisode de léchage. Pour les enregistrements GRAB-DA, les réponses de léchage (orales) ont été définies comme le changement moyen de fluorescence ΔF/F0 dans les 30 s suivant le début du premier épisode de léchage. Tout au long de l'article, une beuverie est définie comme tout ensemble de coups de langue d'une durée de dix secondes ou plus au cours desquels aucun intervalle entre les coups de langue n'est supérieur à deux secondes. Pour la formation de préférence fluide, tous les épisodes de léchage pour une seule souris ont été moyennés et traités comme une seule réplique.

Les réponses gastro-intestinales ont été définies comme des changements moyens d'activité survenant dans les 12 minutes suivant le début de la perfusion intragastrique (sur la base de la durée de la plupart des perfusions dans cet article, ainsi que du temps de montée de la réponse systémique).

Les réponses systémiques (d'absorption) ont été initialement définies (Fig. 1) comme des changements moyens d'activité survenant après la suppression de l'accès à la solution ou la fin de la perfusion intragastrique et de l'injection intrapéritonéale. Sur la base d'une analyse ultérieure du temps de montée (10 à 14 après le début de la consommation d'alcool et de la perfusion intragastrique) et pour s'assurer que les réponses systémiques étaient distinctes de celles de la phase gastro-intestinale, les réponses systémiques (absorptives) ont été redéfinies comme des changements moyens d'activité se produisant 12 à 32 min après le début de la perfusion intragastrique ou du premier épisode de léchage pour les enregistrements microendoscopiques (ou 12 à 50 min après le début de la perfusion intragastrique ou du premier épisode de léchage pour les enregistrements photométriques). Dans les enregistrements photométriques et microendoscopiques, les réponses systémiques ont été définies comme 0 à 30 min après l'injection intrapéritonéale. Le temps de montée a été calculé comme le temps qu'il faut à un neurone activé ou inhibé pour atteindre 50% de son changement d'activité maximal dans un ajustement sigmoïdal. Un neurone était considéré comme inhibé à une époque particulière si le changement moyen d'activité était plus négatif que -1z, et activé si le changement moyen d'activité était plus positif que +1z.

L'accélération de la tête a été définie comme la somme rectifiée de l'accélération dans tous les axes à partir de l'accéléromètre positionné sur la caméra nVista/nVoke (voir « Enregistrements au microendoscope »). Ce signal sommé a été filtré à 5 Hz avec un filtre Butterworth à phase zéro du troisième ordre (pour supprimer les transitoires). L'accélération en dessous d'un seuil (défini par la méthode d'Otsu) a été utilisée pour distinguer le mouvement du repos.

Tout au long de cet article, les valeurs sont généralement rapportées sous forme de moyenne ± sem (barres d'erreur ou zone ombrée). Dans les figures avec des régressions linéaires simples, les zones ombrées représentent l'intervalle de confiance à 95 % pour la ligne de meilleur ajustement. À l'exception des régressions linéaires, des tests non paramétriques ont été uniformément utilisés. Les valeurs P pour les comparaisons appariées et non appariées ont été calculées à l'aide de tests de permutation bilatéraux (10 000 itérations ou exactes lorsque cela est possible). Les valeurs P pour les comparaisons entre plusieurs groupes ont été initialement évaluées à l'aide de l'ANOVA, mais rapportées en tant que valeurs issues de tests de permutation bilatéraux. Parfois, des tests de permutation unilatéraux ont été effectués lorsqu'un résultat particulier était clairement attendu des expériences effectuées plus tôt dans l'article (des tests unilatéraux ont été utilisés pour la Fig. 5e et la Fig. 9b des données étendues, et tout au long de la Fig. 4 et de la Fig. . 8). Pour les principaux résultats de la Fig. 1, les corrélations intra-classe71 (= variance entre les souris/variance totale) et les effets du modèle mixte linéaire ont été calculés (tableau de données étendu 1) pour s'assurer que les effets n'étaient pas dus à des valeurs aberrantes provenant d'une souris. Des calculs de puissance ont été utilisés pour prédéterminer la taille de l'échantillon lorsque la prédiction de la taille de l'effet était possible sur la base d'expériences précédentes (par exemple, un calcul de puissance a été utilisé pour la figure 5e mais pas pour la figure 5b). Les expériences n'étaient pas randomisées. Les enquêteurs ont été aveuglés à l'attribution au cours des expériences et à l'évaluation des résultats au cours des deux expériences de silence VTA-DA.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Des liens vers le code utilisé pour l'analyse des données sont fournis dans les méthodes.

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Nous remercions Y. Chen, C. Zimmerman, A. Mamaligas et les membres du laboratoire Knight pour leurs commentaires sur le manuscrit, et C. Zimmerman pour les illustrations. Ce travail a été soutenu par R01-DK106399 (ZAK), RF1-NS116626 (ZAK, ACK et JDB) et F31-NS120468 (JCRG). ZAK est chercheur au Howard Hughes Medical Institute.

Département de physiologie, Université de Californie, San Francisco, San Francisco, Californie, États-Unis

James CR Grove, Anatol C. Kreitzer et Zachary A. Knight

Kavli Institute for Fundamental Neuroscience, Université de Californie, San Francisco, San Francisco, Californie, États-Unis

James CR Grove et Zachary A. Knight

Programme d'études supérieures en neurosciences, Université de Californie, San Francisco, San Francisco, Californie, États-Unis

James CR Grove, Joshua D. Berke, Anatol C. Kreitzer et Zachary A. Knight

Institut médical Howard Hughes, San Francisco, Californie, États-Unis

Lindsay A. Gray, Naymalis La Santa Medina, Nilla Sivakumar, Jamie S. Ahn, Timothy V. Corpuz et Zachary A. Knight

Département de neurologie, Université de Californie, San Francisco, San Francisco, Californie, États-Unis

Joshua D. Berke et Anatol C. Kreitzer

Weill Institute for Neurosciences, Université de Californie, San Francisco, San Francisco, Californie, États-Unis

Joshua D. Berke, Anatol C. Kreitzer et Zachary A. Knight

Gladstone Institutes, San Francisco, Californie, États-Unis

Anatole C.Kreitzer

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JCRG et ZAK ont conçu des expériences et analysé et interprété des données. Le JCRG a dirigé et réalisé toutes les expériences. JCRG, LAG, NLSM et JSA ont effectué des chirurgies intragastriques. JCRG et NS ont réalisé des expériences optogénétiques. JCRG et TVC ont réalisé des expériences de photométrie. JCRG et ZAK ont écrit le manuscrit avec la contribution de ACK et JDB

Correspondance à Zachary A. Knight.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Paul Kenny et les autres examinateurs, anonymes, pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Enregistrement d'images séparées d'une heure avec des limites cellulaires générées par CNMFe chez des souris non soumises à manipulation. b, Dynamique des neurones VTA-DA lors d'un épisode de léchage d'eau et score z pondéré en fonction de la population des neurones activés (rouge) ou inhibés (bleu) de 0 à 30 s après le début du premier épisode de léchage. c, Traces d'activité de neurones individuels pendant et après la consommation d'eau (voir Fig. 1c pour des exemples supplémentaires). d, score z moyen des neurones activés après avoir bu de l'eau et illustration de la façon dont le temps de montée à 50 % (T50) est calculé pour les neurones répondant à l'infusion d'eau IG. L'heure d'accès à l'eau est indiquée ("lèches d'eau"). e, taux de pointe moyen déduit des neurones DA activés après l'ingestion d'eau. f, g Changements inférés du taux de pointe (f) et de la fluorescence de base (g; voir Méthodes) dans les neurones DA activés après l'ingestion d'eau. h, Pourcentage de neurones activés et inhibés après ingestion d'eau pour quatre souris de la Fig. 1d. i, boîtes à moustaches récapitulatives montrant le changement d'activité noté z après l'ingestion d'eau pour chaque neurone chez chacune des quatre souris (corrélation intra-classe ou ICC = varentre souris/vartotal). j, lèchements cumulatifs pour boire de l'eau ou une solution saline hypertonique (0,3 M NaCl) à son rythme pour les souris assoiffées (n = 4 et 3). k, (à gauche) Réponses de neurones individuels pendant et après la consommation de solution saline hypertonique (0,3 M NaCl). (À droite) Activité moyenne notée z des neurones activés (rouge), inhibés (bleu) et non affectés (gris) après ingestion de solution saline. l, Activité moyenne notée z pendant la perfusion d'eau IG (de la Fig. 1c) en utilisant différents seuils de score z pour définir la population activée et inhibée. m, Boîtes à moustaches récapitulatives montrant le changement d'activité noté z après l'infusion d'eau IG pour chaque neurone séparé par la souris (les données proviennent de tous les enregistrements pendant l'infusion d'eau IG chez des souris déshydratées ; chaque réplicat est une souris différente ; de la Fig. 1 et des Figs de données étendues 1, 6). n, les points de données sont le changement d'activité moyen noté z (pour tous les neurones) pour chaque souris montrée dans le panneau m. Le graphique à barres montre la moyenne de ces scores z moyens. o, Activité moyenne des neurones activés suite à une perfusion IG d'eau à des vitesses de 0,1 ml/min (lente) et 0,2 ml/min (rapide) et un graphique récapitulatif du T50. p, accélération moyenne de la tête pendant et après l'infusion d'eau IG (n = 3 souris). q, réponses moyennes des neurones activés et inhibés (score z pondéré en fonction de la population) après perfusion IG de différents volumes d'eau chez des souris rassasiées et privées d'eau. r, réponses moyennes des neurones activés et inhibés (score z pondéré en fonction de la population) après des injections IP de 0,12 ml de NaCl 3 M, de NaCl 1 M et de mannitol 2 M. Notez que le NaCl 1 M et le mannitol 2 M sont équiosmotiques. s, réponse moyenne des neurones inhibés par l'injection de NaCl dans la veine caudale (un zoom avant montre une échelle de temps plus courte pour illustrer la réponse rapide). t, Réponses moyennes et proportion de neurones activés et inhibés après injection dans la veine caudale (astérisques du test de permutation appliqué à tous les neurones). u, Dynamique des neurones individuels activés lors de la perfusion d'eau IG (1,2 mL). u, Dynamique des neurones individuels activés lors de la perfusion d'eau IG (1,2 mL). v, Lingettes oculaires déclenchées dans les 15 s suivant l'administration oculaire de capsaïcine à 0,1 %. Ceci a été réalisé trois jours après l'injection IP de 50 mg/kg de capsaïcine ou de solution saline témoin afin de valider fonctionnellement la déafférentation de la capsaïcine. w, Réponses moyennes et proportion de neurones activés et inhibés après perfusion d'eau IG (1,2 mL) chez des souris déshydratées avant et après déafférentation vagale avec 50 mg/kg de capsaïcine. ns.P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Toutes les barres d'erreur affichent les statistiques moyennes ± sem dans le tableau de données étendu 2.

a, les réponses des neurones VTA-DA à l'infusion d'eau IG (de la Fig. 1d) présentent des cas d'activité coordonnée apparente lorsqu'ils sont visualisés sur une échelle de temps de dizaines de minutes. Les points d'activité coordonnée apparente sont indiqués par des flèches. b, Une vue rapprochée des 100 premiers neurones montre que tous les neurones ne participent pas à cette activité coordonnée. c, La dynamique agrandie des 100 premiers neurones montre qu'une grande partie de cette activité n'est pas coordonnée sur l'échelle de temps des secondes.

a, Réponse moyenne des neurones VTA-DA lors d'un combat de léchage Ensure. b, Activité neuronale moyenne pendant la consommation d'eau et Ensure, représentée par la trace moyenne et le tracé récapitulatif. La "réponse de léchage" est définie comme le changement d'activité moyen noté z de 0 à 30 s après le début de la consommation. La "réponse retardée" est définie comme le changement moyen d'activité noté z de 0 à 20 min après la fin de la consommation. c, Réponses des neurones VTA-DA individuels pendant et après la perfusion IG d'Ensure et d'eau (1,2 ml). Les neurones sont séparés selon qu'ils sont activés le plus fortement pendant ou après la perfusion d'IG. d, Réponses moyennes des neurones activés et inhibés pendant et après la perfusion d'IG (score z pondéré en fonction de la population, tel que défini à la Fig. 1). e, Temps de montée des neurones activés (d'après Extended Data Fig. 2c). ns.P > 0,05, ***P < 0,001, par test de permutation. Toutes les barres d'erreur et les lignes ombrées indiquent la moyenne ± sem

a, cartes de réglage montrant les réponses individuelles des neurones DA pendant la consommation d'eau et après l'ingestion. b, Proportion de neurones activés lors de la consommation d'eau et post-ingestion et corrélation d'activité. c, Proportion de neurones activés lors de la consommation d'eau et lors de l'infusion d'eau IG et corrélation d'activité. d, Proportion de neurones activés après l'ingestion d'eau et pendant l'infusion d'eau IG et corrélation d'activité. e, Exemple de traces de neurones s'activant à la fois après une infusion d'eau IG et après une consommation d'eau à son propre rythme, ainsi que la proportion de neurones activés par les deux et la corrélation de l'activité. f, Proportion de neurones activés après perfusion d'Ensure IG et après injection IP de glucose et corrélation d'activité. g, Proportion de neurones inhibés après perfusion IG et injection IP de NaCl et corrélation d'activité. h, Réponses des neurones individuels lors de la perfusion IG d'Ensure et de glucose, parallèlement à la corrélation de l'activité des neurones suivis. Statistiques dans le tableau de données étendu 2.

a, (Gauche) Image représentative du placement de la lentille GRIN pour l'imagerie des neurones LH. Barre d'échelle, 0,5 mm. (Droite) Activité pondérée en fonction de la population et proportions de neurones LH-GABA activés (rouge), inhibés (bleu) et non affectés (gris) après une perfusion IG (1,2 ml) d'eau (388 neurones/3 souris) et Ensure (169 neurones/3 souris). b, temps de montée des neurones LH-GABA (à partir de a) et VTA-DA (à partir des Figs. 1e, 2b à c) activés après une perfusion IG d'assurer ou d'eau (1, 2 ml). c, Dynamique des neurones LH-GABA individuels après injection IP de solution saline hypertonique (3 M NaCl, 0,12 mL ; 5 souris). d, (Gauche) Schéma pour l'imagerie par microendoscope des neurones LH-GABA → VTA. (Droite) Split-plot et proportion de neurones de projection activés, inhibés et non affectés après infusion d'eau (160 neurones/3 souris) et Ensure (150 neurones/3 souris). e, Schéma pour l'imagerie microendoscope simultanée des neurones VTA-GABA et la stimulation optogénétique des terminaisons neuronales LH-GABA, parallèlement à la dynamique des neurones VTA-GABA individuels lors de la stimulation des terminaisons neuronales LH-GABA (3 souris). Toutes les lignes ombrées montrent la moyenne ± sem

a, (Gauche) Schéma pour l'imagerie microendoscope simultanée des neurones VTA-DA et l'activation optogénétique des neurones "soif" SFO. (Moyen) Effet de l'activation des neurones SFO sur la consommation d'eau (5 min chez des souris rassasiées ; n = 3 souris). (Droite) Graphiques à barres récapitulatifs et pourcentages de neurones VTA-DA activés (rouge) ou inhibés (bleu) par injection IP de solution saline ou de CNO. b, Réponses moyennes et proportion de neurones activés et inhibés lors de la perfusion d'eau IG (1,2 ml) après activation des neurones SFO, privation d'eau ou ni l'un ni l'autre. c, (à gauche) Schéma pour l'imagerie microendoscope simultanée des neurones VTA-DA et l'activation optogénétique des neurones AgRP "faim". (Moyen) Effet de l'activation des neurones AgRP sur la prise alimentaire (5 min chez des souris rassasiées ; n = 3 souris). (À droite) Réponses moyennes et proportion de neurones activés et inhibés après l'activation ou le contrôle des neurones AgRP. d, (Gauche) Dynamique des neurones individuels. (À droite) Réponses moyennes et proportion de neurones activés et inhibés après une perfusion IG d'Ensure (0,6 ml) après l'activation des neurones AgRP, la privation de nourriture ou aucune. Notez que la privation de nourriture et la stimulation des neurones AgRP réduisent de manière contre-intuitive les réponses DA aux nutriments IG. e, Réponses moyennes et proportion de neurones activés et inhibés après injection intrapéritonéale (IP) de glucose à 50 % (0,3 ml) après activation des neurones AgRP, privation de nourriture ou ni l'un ni l'autre. f, Réponses moyennes et proportion de neurones activés et inhibés pendant la perfusion IG d'Ensure (0,6 ml) après l'activation des neurones AgRP, la privation de nourriture ou ni l'un ni l'autre. g, (Gauche) Schéma pour l'imagerie microendoscope simultanée des neurones LH-GABA → VTA et l'activation chimiogénétique (hM3Dq) des neurones "soif" SFO. (Milieu) Graphiques à barres récapitulatifs et pourcentages de neurones LH-GABA → VTA activés (rouge) ou inhibés (bleu) par une solution saline ou CNO. (Droite) Graphiques à barres récapitulatifs et pourcentages de neurones LH-GABA → VTA activés (rouge) ou inhibés (bleu) après perfusion IG d'eau (1,2 ml). salut, Réponses à la nourriture et à l'eau dans un état de besoin orthogonal. h, Réponses moyennes et proportion de neurones VTA-DA activés et inhibés après une perfusion d'eau IG (1,2 ml) alors qu'ils étaient rassasiés ou privés de nourriture. i, Réponses moyennes et proportion de neurones VTA-DA activés et inhibés après une perfusion d'Ig Ensure (1,2 ml) alors qu'ils étaient rassasiés ou déshydratés. j, Réponses moyennes et proportion de neurones VTA-DA activés et inhibés après perfusion IG de solution saline hypertonique (0,3 M NaCl, 1,2 ml) chez des souris rassasiées ou appauvries en sodium. ns.P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Toutes les barres d'erreur affichent les statistiques moyennes ± sem dans le tableau de données étendu 2.

a, Réponses moyennes de fluorescence GRAB-DA dans BLA pendant et après la perfusion IG d'Ensure ou la perfusion fictive en utilisant des longueurs d'onde d'excitation de 405 nm et 470 nm. Notez l'échelle de temps de l'enregistrement. b, réponses GRAB-DA moyennes à 470 nm d'excitation lorsqu'elles sont normalisées à la réponse "isosbestique" à 405 nm. c, réponses GRAB-DA moyennes à une excitation de 470 nm lorsqu'elles sont normalisées à l'aide d'un ajustement exponentiel à la décroissance de la fluorescence dans la période de référence. Statistiques dans le tableau de données étendu 3.

a, Emplacements approximatifs (points) des fibres de photométrie pour les enregistrements GRAB-DA, aux côtés d'images représentatives. Barre d'échelle, 1 mm. b, réponses de fluorescence GRAB-DA dans VTA et DS aux changements systémiques d'hydratation suite à une perfusion IG (1,2 ml) d'eau ou de solution saline hypertonique (0,3 M NaCl). c, réponses GRAB-DA dans VTA et DS après perfusion IG (1,2 ml) d'eau et Ensure pendant l'état rassasié et après une privation de nourriture ou d'eau. d, réponses GRAB-DA moyennes dans VTA pendant et après l'injection IP d'eau. e, Dynamique des neurones de projection BLA et NAc pendant et après l'infusion d'eau IG (voir Fig. 4e). f, réponses GRAB-DA moyennes pendant la consommation d'alcool à son propre rythme (rangées du haut et du bas) et la perfusion IG (1,2 mL, rangée du milieu) d'eau (bleu), 300 mM de NaCl (gris) et Ensure (orange). ns.P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Toutes les barres d'erreur et les lignes ombrées affichent les statistiques moyennes ± sem dans les tableaux de données étendus 2, 3.

a, Graphiques récapitulatifs de la consommation de chaque solution chaque jour d'entraînement de préférence de liquide en utilisant le protocole dans lequel les souris ont accès à de l'eau pendant 60 minutes chaque jour d'entraînement (voir Fig. 5c). b, L'illumination des neurones VTA-DA tout au long de la session de formation (60 min) empêche l'apprentissage des préférences chez les souris exprimant GtACR mais pas chez les témoins exprimant mCherry. c, (Gauche) Protocole d'entraînement révisé dans lequel l'accès à l'eau est supprimé après 10 min de consommation à chaque séance d'entraînement. (À droite) Un apprentissage robuste des préférences se produit même avec seulement 10 minutes d'accès (c'est-à-dire que l'eau est retirée avant que l'activité VTA-DA ait changé en raison de changements post-absorptifs ; n = 6). d, Changements dans la consommation totale les premier et dernier jours de formation dans l'expérience de silence différé (Fig. 5e). ns.P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01. Toutes les barres d'erreur et les lignes ombrées affichent les statistiques moyennes ± sem dans le tableau de données étendu 4.

a, fluorescence GRAB-DA dans mSh et BLA lors de la consommation de la solution hydratante les premier et dernier jours d'entraînement (voir Fig. 5e). b, Tracés récapitulatifs des réponses GRAB-DA déclenchées par le léchage les premiers jours de formation avec chaque solution. ns.P > 0,05. Toutes les barres d'erreur et les lignes ombrées affichent les statistiques moyennes ± sem dans le tableau de données étendu 3.

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Réimpressions et autorisations

Grove, JCR, Gray, LA, La Santa Medina, N. et al. Sous-systèmes de dopamine qui suivent les états internes. Nature 608, 374-380 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04954-0

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Reçu : 30 mars 2021

Accepté : 08 juin 2022

Publié: 13 juillet 2022

Date d'émission : 11 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-022-04954-0

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