Souris sans PSD

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 16410 (2015) Citer cet article

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L'ubiquitination des protéines a une influence significative sur divers aspects du développement et de la fonction neuronale. Dorfin, également connu sous le nom de Rnf19a, est une ligase d'ubiquitine E3 doigt RING impliquée dans la sclérose latérale amyotrophique et la maladie de Parkinson, mais ses fonctions in vivo n'ont pas été explorées. Nous rapportons ici que Dorfin est un nouveau partenaire de liaison de la protéine d'échafaudage post-synaptique excitatrice PSD-95. Les souris mutantes Dorfin (Dorfin-/-) présentent une neurogenèse adulte réduite et une potentialisation à long terme accrue dans le gyrus denté de l'hippocampe, mais une potentialisation à long terme normale dans la région CA1. Sur le plan comportemental, les souris Dorfin-/- présentent une altération du conditionnement de la peur contextuelle, mais des niveaux normaux de conditionnement de la peur, d'extinction de la peur, d'apprentissage et de mémoire spatiaux, de mémoire de reconnaissance d'objets, de mémoire de travail spatiale et de séparation des motifs. En utilisant une approche protéomique, nous identifions également un certain nombre de protéines dont les niveaux d'ubiquitination sont diminués dans le cerveau Dorfin−/−. Ces résultats suggèrent que Dorfin pourrait réguler la neurogenèse adulte, la plasticité synaptique et la mémoire contextuelle de la peur.

L'ubiquitination des protéines régule divers aspects du développement et de la fonction neuronale. Les ligases d'ubiquitine E3, qui se comptent par centaines (~ 400 à 500 chez la souris et l'homme), sont des composants clés du système d'ubiquitination des protéines, jouant un rôle important dans la détermination de la spécificité du substrat. L'ubiquitination des protéines est connue pour entraîner la dégradation des protéines par le protéasome 26S ; cependant, l'accumulation de preuves indique qu'il remplit également des fonctions supplémentaires, telles que la régulation de la fonction protéique, le trafic et la localisation subcellulaire, ainsi que les interactions protéine-protéine.

L'ubiquitination des protéines dans le système nerveux régule différentes étapes du développement neuronal, y compris la neurogenèse, la migration, la neuritogenèse et la synaptogenèse1,2,3,4,5. De plus, on pense que l'ubiquitination des protéines synaptiques régule divers aspects de la structure, de la fonction et de la plasticité synaptiques. Les substrats connus de l'ubiquitination synaptique comprennent les protéines d'échafaudage/adaptateur, les récepteurs et les molécules de signalisation. Des exemples spécifiques et des ligases E3 associées incluent PSD-95–Mdm26, GKAP/SAPAP–Trim37,8, Shank/ProSAP7, SPAR–βTRCP9,10, AKAP79/1507, Homer-1a11, CaMKIIα12, liprin-α1–APC/C13,14 , éphéxine-5–Ube3A15, Arc–Ube3a/Triad3a16,17, récepteurs AMPA (AMPAR)–Nedd4-1/RNF167/APC/C14,18,19,20,21,22, récepteurs NMDA (NMDAR)–Mib223, mGluR1α –Siah1A24,25, mGluR5–Siah1A25, récepteurs GABAA (sous-unité γ2)26,27, Munc13-1–Fbxo4528, RIM1–SCRAPPER29 et Piccolo/Basson–Siah1A30.

Dorfin, une ligase d'ubiquitine RING finger E3, a été identifiée à l'origine comme un composant du corps XY des spermatocytes et des centrosomes31. Dorfin (840 acides aminés de long chez la souris) contient deux domaines RING flanquant le domaine de l'anneau intermédiaire (IBR) et deux domaines transmembranaires, bien que la topologie membranaire précise de la protéine ne soit pas bien établie. Des études antérieures ont impliqué Dorfin dans la sclérose latérale amyotrophique familiale (SLA) et la maladie de Parkinson32,33,34,35,36,37,38,39,40. À l'appui du rôle neuroprotecteur de Dorfin dans la SLA, Dorfin ubiquitine la protéine SOD1 (superoxyde dismutase 1) mutante associée à la SLA33 et, lorsqu'elle est surexprimée dans un modèle murin de SLA familiale, réduit la quantité de protéines SOD1 mutantes et supprime les phénotypes neurologiques et moteurs. mort des neurones40. Cependant, on sait peu de choses sur les fonctions de Dorfin dans le cerveau normal, y compris ses interactions protéine-protéine, les protéines substrats et les conséquences fonctionnelles de l'ubiquitination des protéines substrats. De plus, les fonctions in vivo de Dorfin n'ont pas été explorées à l'aide d'approches d'inactivation de gènes.

Dans la présente étude, nous avons constaté que Dorfin interagit avec l'abondante protéine d'échafaudage postsynaptique excitatrice PSD-95. Les souris Dorfin-/- présentent une neurogenèse adulte supprimée et une potentialisation à long terme (LTP) améliorée dans le gyrus denté (DG) et un conditionnement contextuel de la peur altéré, ce qui suggère que Dorfin est important pour la neurogenèse adulte, la plasticité synaptique, l'apprentissage et la mémoire.

À l'aide d'un test à deux hybrides de levure pour cribler une bibliothèque d'ADNc de cerveau de souris, nous avons identifié Dorfin/Rnf19a comme un nouveau partenaire de liaison de PSD-95. Dorfin contient deux domaines RING séparés par le domaine IBR dans la moitié N-terminale suivi de deux domaines transmembranaires putatifs et d'un motif de liaison au domaine PDZ C-terminal (Fig. 1A). Les sept derniers acides aminés de Dorfin ont interagi avec les domaines PDZ1 et PDZ2, mais pas PDZ3, de PSD-95 (Fig. 1B). Dorfin a également interagi avec les domaines PDZ des parents PSD-95 (PSD-93/Chapsyn-110, SAP97, SAP102), mais pas avec ceux de S-SCAM, GRIP2 ou Shank1. Un Dorfin mutant, dans lequel le dernier résidu d'acide aminé a été muté (I840A), n'a pas réussi à interagir avec PSD-95, indiquant une interaction PDZ canonique. Ces interactions PDZ ont été vérifiées par des tests GST-pull down, qui ont montré que les protéines de la famille PSD-95 pleine longueur exprimées dans des cellules hétérologues étaient réduites par GST-Dorfin, bien que PSD-93 et ​​SAP102 aient montré des interactions plus faibles par rapport à PSD-95 et SAP97 (figure 1C). Des expériences de co-immunoprécipitation in vitro ont confirmé indépendamment les interactions PDZ-dépendantes de Dorfin avec PSD-95 et SAP97 (Fig. 1D, E).

Dorfin interagit avec les protéines de la famille PSD-95 dans les tests de double hybride de levure, de pull-down GST et de co-immunoprécipitation.

(A) Structure de domaine de la souris Dorfin. IBR, anneau intermédiaire ; TM, domaine transmembranaire ; PB, motif de liaison au domaine PDZ. (B) Interactions bi-hybrides de levure de Dorfin avec PSD-95. Les domaines PDZ des protéines de la famille PSD-95, S-SCAM et d'autres protéines PDZ dans pGAD10 (vecteur proie) ont été testés pour la liaison à Dorfin (aa 834–840; type sauvage et le mutant I840A, dans lequel le dernier résidu Ile a été changé en Ala) dans pBHA (vecteur appât) dans des essais à deux hybrides de levure. Activité β-galactosidase (β-Gal) : +++, < 45 min ; ++, 45 à 90 minutes ; +, 90–240 min ; -, pas d'activité β-Gal significative. Activité HIS3 : +++, >60% ; ++, 30–60 % ;, +, 10–30 % ; −, pas de croissance significative. (C) Tirez vers le bas des protéines de la famille PSD-95 pleine longueur et contrôlez les protéines PDZ (S-SCAM et GRIP2) par les protéines de fusion GST-Dorfin. GST-Dorfin (aa 834–840; WT et I840A), ou GST seul, a été utilisé pour réduire les protéines indiquées exprimées dans les cellules HEK293T, suivies d'un immunotransfert. (D,E) Coimmunoprécipitation de Dorfin avec PSD-95 ou SAP97. Les cellules HEK293T doublement transfectées avec Flag-Dorfin (pleine longueur; WT ou Δ3 manquant les trois derniers résidus aa) et PSD-95, ou SAP97, ont été immunoprécipitées (IP) avec des anticorps Flag et immunotransférées avec les anticorps indiqués.

Afin d'explorer les fonctions in vivo de Dorfin, nous avons généré des souris Dorfin-/- en utilisant une approche de piège à gènes dans laquelle l'intron entre les exons 2 et 3 du gène Dorfin était ciblé (Fig. 2A). L'allèle piégé a été vérifié par génotypage par réaction en chaîne par polymérase (PCR) (Fig. 2B). La PCR de transcription inverse (RT-PCR) et la PCR quantitative (qPCR) ont révélé que l'ARNm de Dorfin était indétectable à la fois dans le cortex et l'hippocampe des souris Dorfin-/- (Fig. 2C – E).

Génération de souris Dorfin−/−.

(A) Schéma illustrant la structure du gène Dorfin montrant les exons et les introns et le site d'insertion du piège à gènes dans l'intron entre l'exon 2 et l'exon 3. (B) Identification du gène Dorfin piégé par génotypage PCR. (C) Emplacements des amorces pour RT-PCR et qPCR et une sonde pour l'hybridation in situ dans le gène Dorfin de souris. (D,E) Expression indétectable de l'ARNm de Dorfin dans le cerveau de Dorfin-/- (2 mois) par RT-PCR conventionnelle et qPCR. (F) Modèles de distribution des ARNm de Dorfin dans les sections de cerveau de souris WT et Dorfin-/- (2 mois) révélés par hybridation in situ. Régions CA1 et DG, CA1 et DG de l'hippocampe. Barre d'échelle, 1 mm. (G) Schémas de distribution de l'ARNm de Dorfin dans des coupes de cerveau de rat WT (3 mois) révélés par hybridation in situ. Cb, cervelet ; CPu, caudé-putamen ; CTX, cortex cérébral ; OB, bulbe olfactif ; Fosse, glande pituitaire. Barre d'échelle, 5 mm.

Des expériences d'hybridation in situ sur des cerveaux de type sauvage (WT) et Dorfin-/- ont indiqué que l'ARNm de Dorfin est largement exprimé dans diverses régions cérébrales de souris WT, y compris le cortex et l'hippocampe, alors que les signaux étaient presque indétectables dans le cerveau Dorfin-/- (Fig. 2F). Des signaux d'ARNm de Dorfin répandus ont également été observés dans le cerveau des rats (Fig. 2G). Notamment, les signaux d'ARNm de Dorfin dans l'hippocampe étaient plus forts dans la région DG que dans la région CA1, en particulier dans le cerveau de la souris. Nos résultats sont largement en accord avec les données de l'Allen Brain Atlas (http://www.brain-map.org/) pour l'ARNm de Dorfin de souris. Malgré des tentatives répétées, nous n'avons pas pu caractériser les schémas d'expression/distribution de la protéine Dorfin car les anticorps appropriés font défaut.

La coloration immunohistochimique des cerveaux WT et Dorfin-/- à l'aide d'anticorps dirigés contre NeuN, un marqueur neuronal, a révélé que les cerveaux Dorfin-/- avaient une morphologie brute normale aux semaines postnatales 4 et 8 (Fig. 3A, B). De plus, une analyse Sholl des neurones injectés de biocytine a indiqué que les principaux neurones Dorfin-/- dans les régions DG et CA1 de l'hippocampe ont une morphologie dendritique normale (Fig. 3C – G). Les souris Dorfin-/- ont grandi normalement pendant les semaines postnatales 4 à 8, les mâles et les femelles affichant des poids corporels comparables à ceux des souris WT (Fig. 3H). De plus, des analyses par immunoblot de lysats d'hippocampe, de la fraction synaptosomale brute d'hippocampe et de lysats de DG microdisséqués ont révélé que les niveaux d'échafaudage synaptique et de protéines réceptrices n'étaient pas différents entre les génotypes (Fig. 3I).

Caractérisation générale des souris Dorfin−/−.

(A, B) Morphologie brute normale du cerveau Dorfin-/- aux semaines postnatales 4 et 8, déterminée par la coloration du marqueur neuronal NeuN dans les sections coronales et sagittales. Barre d'échelle, 1,0 mm. (C – G) Morphologie dendritique normale des neurones principaux dans les régions CA1 et DG de l'hippocampe (2 semaines), comme démontré par l'injection de biocytine et l'analyse Sholl. Barre d'échelle, 50 μm. (sem, CA1 basal, n = 6 cellules de 4 souris pour WT et 7, 5 pour KO ; CA1 apical, n = 7, 4 pour WT et 7, 5 pour KO ; DG, n = 7, 5 pour WT et 6 , 5 pour KO). (H) Poids corporels normaux des souris Dorfin-/- mâles et femelles pendant les semaines postnatales 4 à 8. (sem, n = 17 pour l'homme WT, 19 pour l'homme KO, 17 pour la femme WT et 14 pour la femme KO). (I) Niveaux normaux d'échafaudage synaptique et de protéines réceptrices dans l'hippocampe de Dorfin-/- (2 à 3 mois), comme en témoigne l'analyse par immunotransfert de lysats d'hippocampe entiers, la fraction brute d'hippocampe synaptosomal (P2) et les lysats de DG entiers microdisséqués (sem , n = 3–6 pour WT et KO).

Parce que Dorfin interagit avec PSD-95, une protéine d'échafaudage synaptique excitatrice abondante, nous avons exploré les altérations possibles de la transmission synaptique excitatrice chez les souris Dorfin-/-. Les cellules granulaires de la région Dorfin - / - DG ont montré une augmentation de l'amplitude, mais pas de la fréquence, des courants post-synaptiques excitateurs miniatures (mEPSC) par rapport aux neurones WT (Fig. 4A). En revanche, la fréquence et l'amplitude des courants postsynaptiques inhibiteurs miniatures (mIPSC) étaient normales dans ces neurones (Fig. 4B). De plus, la courbe entrée-sortie au niveau des synapses de la voie perforante médiane de Dorfin − / − sur les cellules granulaires DG (synapses MPP-DG) était normale, telle que mesurée par les pentes des EPSP de champ (fEPSP) tracées par rapport aux amplitudes de volley de fibre (Fig. 4C ). Enfin, les tracés du rapport d'impulsions appariées par rapport aux intervalles inter-stimulus étaient normaux (Fig. 4D), suggérant une probabilité de libération présynaptique inchangée.

LTP amélioré dans la région DG, mais pas CA1, de l'hippocampe Dorfin-/-.

(A) Augmentation de l'amplitude, mais fréquence normale, des mEPSC dans les cellules granulaires Dorfin-/- DG (P15–17, sem, n = 19 cellules de 5 souris pour WT et 21, 3 pour KO, *p < 0,05, ns, non significatif, test t de Student). (B) Fréquence normale et amplitude des mIPSC dans les cellules granulaires Dorfin-/- DG (P15–17, sem, n = 17, 4 pour WT et 15, 4 pour KO, ns, non significatif, test t de Student). (C) Courbe d'entrée-sortie normale, déterminée en traçant les pentes du champ EPSP (fEPSP) par rapport aux amplitudes de volley de fibre aux synapses Dorfin-/- MPP-DG (3 semaines, n = 11 tranches de 4 souris pour WT et 13, 4 pour KO ). (D) Rapport d'impulsion apparié normal, déterminé en traçant les rapports de deux pentes fEPSP consécutives par rapport aux intervalles inter-stimulus aux synapses Dorfin-/- MPP-DG (3 semaines, n = 11 tranches de 4 souris WT et 13, 4 pour KO ). (E) LTP améliorée induite par quatre trains de HFS au niveau des synapses Dorfin−/− MPP-DG (4 semaines, sem, n = 7 tranches de 4 souris pour WT et 8, 7 pour KO, *p < 0,05, Student's t- test). (F) Rapport NMDA/AMPA normal au niveau des synapses Dorfin−/− MPP-DG, déterminé en comparant les pentes évoquées de fEPSP aux potentiels de maintien de −70 (AMPA) et +40 (NMDA) mV (3 semaines, sem, n = 11 cellules de 6 souris pour WT et 8, 4 pour KO, ns, non significatif, test t de Student). (G) Fréquence normale et amplitude des mEPSC dans les cellules pyramidales Dorfin-/- CA1 (P15–17, sem, n = 14 cellules de 3 souris pour WT et 11, 3 pour KO, ns, non significatif, test t de Student) . (H) Fréquence et amplitude normales des mIPSC dans les cellules pyramidales Dorfin−/− CA1 (P15–20, sem, n = 11, 3 pour WT et 13, 4 pour KO, ns, non significatif, test t de Student). (J) LTP normale induite par HFS au niveau des synapses Dorfin-/- SC-CA1 (4 semaines, n = 10 tranches de 6 souris pour WT et 8, 5 pour KO, ns, non significatif, test t de Student).

Curieusement, la LTP au niveau des synapses MPP-DG induite par quatre trains de stimulation à haute fréquence (HFS; 100 Hz) était significativement améliorée chez les souris Dorfin-/- par rapport aux souris WT (Fig. 4E). Cela ne semble pas être attribuable à une augmentation de la fonction NMDAR car le rapport des courants médiés par NMDAR et AMPAR au niveau de ces synapses n'a pas été modifié (Fig. 4F), bien que la LTP au niveau des synapses MPP-DG soit connue pour dépendre des NMDARs41 ,42.

Étant donné que la région CA1 de l'hippocampe exprime également l'ARNm de Dorfin, bien que dans une moindre mesure que le DG, nous avons testé les changements possibles dans mE/IPSC et LTP dans cette région. Nous avons constaté que ni les mEPSC ni les mIPSC n'étaient altérés dans les neurones pyramidaux de Dorfin − / − CA1 (Fig. 4G, H). De plus, la LTP induite par HFS (100 Hz) n'a pas été modifiée au niveau des synapses pyramidales Dorfin-/- Schaffer collatéral-CA1 (SC-CA1) (Fig. 4I). Ces résultats suggèrent que la suppression de Dorfin entraîne une amélioration de la LTP au niveau des synapses MPP-DG, mais pas SC-CA1.

Nous avons ensuite exploré si les souris Dorfin-/- présentaient des anomalies comportementales. Les souris Dorfin-/- ont présenté une activité locomotrice accrue pendant la phase d'extinction dans un environnement familier, telle que mesurée par une surveillance continue de 48 heures des mouvements dans un environnement familier dans lequel les souris avaient été habituées pendant 3 jours avant le test (Fig. 5A ). En revanche, les souris Dorfin-/- ont montré une locomotion normale dans un nouvel environnement, mesurée par le test en champ libre (Fig. 5B), ce qui suggère que les souris Dorfin-/- sont hyperactives dans un environnement familier, mais pas nouveau.

Les souris Dorfin-/- présentent une hyperactivité dans un environnement familier, mais pas dans un environnement nouveau, et présentent des niveaux normaux de comportement anxieux, d'auto-toilette, de propension aux crises, d'interaction sociale et de coordination motrice.

(A) Les souris Dorfin-/- affichent une activité locomotrice accrue dans un environnement familier, telle que mesurée par une surveillance continue de 48 heures des mouvements de la souris dans un environnement familier en moyenne sur un cycle de 24 heures (Laboras, n = 9 souris pour WT et 11 pour KO, ANOVA bidirectionnelle, Bonferroni post-hoc, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05, test t de Student pour la distance parcourue totale). (B) Les souris Dorfin-/- montrent une activité locomotrice normale dans le test en plein champ (nouvel environnement). Notez que le temps passé dans la région centrale est également normal. (sem, n = 13 souris pour WT et 11 pour KO, ns, non significatif, ANOVA bidirectionnelle, Bonferroni post-hoc, test t de Student). (C–E) Les souris Dorfin−/− affichent des niveaux normaux de comportement anxieux dans le labyrinthe surélevé (C), la boîte claire-foncée (D) et les tests d'alimentation avec suppression de la nouveauté (E) (sem, n = 8 souris pour WT et KO dans les tests de labyrinthe en plus élevé et de boîte claire-foncée et 19 pour les souris WT et KO dans le test d'alimentation avec suppression de nouveauté, ns, non significatif, test t de Student). (F–I) Les souris Dorfin−/− présentent des niveaux normaux d'auto-toilettage (F), de crises induites par le PTZ (G), d'interaction sociale à trois chambres (H) et de coordination motrice rotarod (I) (sem, n = 8 souris pour WT et KO [auto-toilettage], 17 pour WT et 14 pour KO [convulsions], 8 pour WT et KO [trois chambres] et 12 pour WT et KO [rotarod], ns, non significatif, t- de Student test).

Nous avons ensuite testé si les souris Dorfin−/− affichaient des comportements anxieux par trois tests différents. Les souris Dorfin-/- ont passé un temps normal dans la région centrale de l'arène à champ ouvert (Fig. 5B), dans le bras ouvert/fermé du labyrinthe plus élevé (Fig. 5C) et dans la chambre claire-obscure de la boîte claire-foncée (Fig. 5D). Dans le test d'alimentation avec suppression de nouveauté, les souris WT et Dorfin-/- ont montré des niveaux comparables de latence pour se nourrir dans un nouveau champ ouvert (Fig. 5E). Ces résultats indiquent que les souris Dorfin-/- ne présentent pas de comportements anxieux.

Enfin, les souris Dorfin-/- ont montré des niveaux normaux de comportement d'auto-toilettage (Fig. 5F), de crises induites par le pentylènetétrazole (PTZ) (Fig. 5G), d'interaction sociale et de reconnaissance de la nouveauté sociale dans le test à trois chambres (Fig. 5H ) et la coordination motrice dans le test rotarod (Fig. 5I). Ces résultats indiquent collectivement que les souris Dorfin-/- montrent une augmentation spécifique de l'activité locomotrice dans un environnement familier, mais pas nouveau, alors que d'autres comportements testés sont normaux.

Étant donné que les souris Dorfin-/- présentent une LTP améliorée dans la région DG de l'hippocampe, nous avons soumis des souris Dorfin-/- à une batterie de tests comportementaux d'apprentissage et de mémoire. Dans le test du labyrinthe aquatique de Morris, qui mesure l'apprentissage spatial et la mémoire43, les souris Dorfin-/- se sont comportées normalement pendant les phases d'apprentissage, de sonde et d'inversion (Fig. 6A). Les souris Dorfin-/- ont également fonctionné normalement dans les tests d'altération récompensée du labyrinthe en T et d'altération spontanée du labyrinthe en T, qui mesurent la mémoire de travail spatiale44 (Fig. 6B, C). Dans le nouveau test de reconnaissance d'objet, qui mesure la mémoire de reconnaissance d'objet et la préférence pour un nouvel objet, les souris WT et Dorfin-/- ont montré une préférence similaire pour le nouvel objet (Fig. 6D).

Les souris Dorfin-/- présentent un déficit spécifique dans la mémoire contextuelle de la peur, mais pas dans les autres types de comportements d'apprentissage et de mémoire.

(A) Les souris Dorfin-/- montrent un apprentissage et une mémoire spatiaux normaux dans les phases d'apprentissage, de sonde et d'inversion du test du labyrinthe aquatique de Morris (T : cible, L : gauche, R : droite, O : opposé, sem, n = 14 souris pour WT et 16 pour KO, ns, non significatif, ANOVA bidirectionnelle, Bonferroni post-hoc, test t de Student). (B,C) Les souris Dorfin−/− affichent une mémoire de travail spatiale normale dans les tests d'altération récompensés (B) et spontanés (C) du labyrinthe en T (8 essais sur 2 jours constituent un bloc ; sem, récompensé, n = 7 pour WT et 8 pour KO ; spontané, n = 9 pour WT et 11 pour KO, ns, non significatif, ANOVA à deux facteurs, Bonferroni post-hoc, test t de Student). (D) Les souris Dorfin-/- affichent une nouvelle préférence d'objet comparable à celle des souris WT (sem, n = 8 pour WT et 10 pour KO, ns, non significatif, test t de Student). (E – G) Les souris Dorfin-/- affichent une mémoire de peur contextuelle réduite, mais une extinction normale de la peur et un conditionnement de la peur indicé. (sem, conditionnement contextuel de la peur, n = 16 pour WT et KO ; extinction contextuelle de la peur, n = 16 pour WT et KO ; conditionnement de la peur indicée, n = 13 pour WT et 15 pour KO, ns, non significatif, ***p < 0,001, ANOVA bidirectionnelle, Bonferroni post-hoc, test t de Student). (H) Les souris Dorfin-/- présentent une neurogenèse supprimée dans le DG adulte. Des tranches d'hippocampe de souris injectées de BrdU (6 semaines) ont été triplement marquées pour BrdU, doublecortine (DCX) et DAPI et le nombre de cellules BrdU-positives ainsi que de cellules doublement positives pour BrdU et DCX normalisées aux cellules DAPI-positives ont été quantifiés. Barre d'échelle, 50 μm. (sem, n = 3 souris pour WT et n = 4 pour KO, * p < 0,05, test t de Student). (I) Séparation normale des motifs chez les souris Dorfin-/-. (sem, n = 9 souris pour WT et n = 7 pour KO, ns, non significatif, test t de Student, ANOVA bidirectionnelle, Bonferroni post-hoc).

Dans le test de conditionnement contextuel de la peur, les souris Dorfin-/- ont montré une congélation réduite dans la même chambre de choc 24 heures après le conditionnement par rapport aux souris WT (Fig. 6E). En revanche, les souris Dorfin-/- ont montré une extinction contextuelle de la peur et un conditionnement de la peur comparables à ceux des souris WT (Fig. 6F, G). Ces résultats suggèrent collectivement que les souris Dorfin-/- ont un déficit spécifique dans le conditionnement contextuel de la peur, mais pas dans les autres types d'apprentissage et de mémoire.

Les augmentations de l'amplitude du mEPSC et de la LTP observées dans la région DG des souris Dorfin-/- pourraient être associées à des altérations de la neurogenèse adulte, connue pour réguler la plasticité synaptique dans le DG45. Lorsque les cellules de la bordure interne de la couche de cellules granulaires DG ont été marquées avec BrdU, un marqueur de cellules en division, le nombre de cellules BrdU-positives a été significativement réduit dans le Dorfin-/- DG adulte (6 semaines), par rapport à celui chez les souris WT (Fig. 6H). De plus, le nombre de cellules doublement positives pour BrdU et doublecortine, un marqueur de neurones nouvellement générés, a été significativement réduit dans le Dorfin-/- DG. Ces résultats indiquent que la suppression de Dorfin conduit à la suppression de la neurogenèse dans le DG adulte.

La neurogenèse chez le DG adulte a été associée à la séparation des modèles spatiaux en plus de l'apprentissage spatial/contextuel et de la mémoire45,46,47. Nous avons ainsi soumis des souris Dorfin-/- au test de discrimination contextuelle et constaté que les souris Dorfin-/- pouvaient normalement apprendre à discriminer deux contextes similaires, dont l'un est associé à un choc du pied (Fig. 6I).

Si Dorfin agit comme une ubiquitine ligase dans le cerveau, nous devrions pouvoir observer des diminutions des niveaux d'ubiquitination des protéines substrats de Dorfin dans le cerveau Dorfin-/-. À cette fin, nous avons immunoprécipité des lysats d'hippocampe à l'aide d'un anticorps qui cible le peptide K-GG dans les protéines ubiquitinées, suivi d'analyses par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) des précipités (Fig. 7A).

Identification protéomique de protéines à ubiquitination réduite dans l'hippocampe de Dorfin−/−.

(A) Procédures d'identification des protéines avec ubiquitination altérée dans le cerveau Dorfin-/-. Les peptides ubiquitinés des lysats d'hippocampe ont été purifiés par immuno-affinité avec l'anticorps K-GG, suivis d'une analyse par spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour le séquençage qualitatif, l'identification et la quantification du site cible. (n = 6 souris pour WT et 8 pour KO dans un échantillon respectivement). (B) Liste des protéines dont les niveaux d'ubiquitination sont diminués de > 2,5 fois dans l'hippocampe Dorfin-/- par rapport aux témoins WT (voir également le tableau supplémentaire 1). Les cercles verts indiquent les protéines dont les niveaux d'expression ont été testés par immunoblot de lysats d'hippocampe (voir également Fig. 7H). (C – G) Dorfin forme un complexe avec cinq protéines sélectionnées dans la liste de la Fig. 7B. Les cellules HEK293 exprimant doublement Myc-Dorfin et les protéines indiquées ont été immunoprécipitées et immunoblottées avec des anticorps Myc ou EGFP. Rab11b (C), NFM (D), PPP1CA (E), PPP1CB (F) et H2AFZ (G). Entrée, 5 %. (H) Niveaux d'expression des protéines dans l'hippocampe Dorfin-/- (2 à 3 mois) par rapport à ceux des témoins WT, tels que déterminés par l'analyse immunoblot de lysats hippocampiques entiers, la fraction hippocampique synaptosomale brute (P2) et les lysats DG entiers microdisséqués . (sem, n = 3–6 pour les hippocampes WT et KO).

Nous avons trié les protéines positives par ordre de plus grande diminution de l'ubiquitination, générant une liste de 24 protéines dont les niveaux d'ubiquitination ont été considérablement diminués (> 2, 5 fois) dans le cerveau Dorfin-/- par rapport aux témoins WT (tableau supplémentaire S1). Ces protéines pourraient être classées en plusieurs groupes fonctionnels, notamment les molécules d'adhésion / matrice extracellulaire, les adaptateurs / échafaudages, les protéines liées aux protéines G, les phosphatases, les protéases, les enzymes et les protéines régulatrices du cycle cellulaire / de la chromatine (Fig. 7B).

À l'aide d'expériences de co-immunoprécipitation dans des cellules hétérologues, nous avons vérifié l'association de certaines de ces protéines avec Dorfin (Fig. 7C – G). Ces protéines comprenaient Rab11b (une petite GTPase), le neurofilament M, les sous-unités α et β de la phosphatase PP1 et l'histone H2A. De manière inattendue, aucune de ces cinq protéines ne s'est avérée ubiquitinée lorsqu'elle est coexprimée avec Dorfin dans des cellules hétérologues (Fig. 1 supplémentaire). De plus, leurs taux de protéines n'étaient pas modifiés chez les souris Dorfin - / -, tels que mesurés par analyse immunoblot des lysats d'hippocampe, de la fraction synaptosomale brute de l'hippocampe et des lysats de DG microdisséqués (Fig. 7H). De plus, il n'y a eu aucun changement dans les niveaux d'expression des autres protéines de la liste, notamment ATP6V1A, Plexin A1 / A4, NPEPPS, 14-3-3 η / ζ et gelsoline (Fig. 7H). Par conséquent, la délétion de Dorfin in vivo ne semble pas provoquer de diminutions détectables des niveaux des protéines testées.

Notre étude indique que la suppression de Dorfin chez la souris entraîne une diminution de la neurogenèse dans le DG, une LTP améliorée dans la voie MPP-DG et un déficit comportemental spécifique dans le conditionnement contextuel de la peur, mais pas dans d'autres types d'apprentissage et de mémoire. Nous avons également identifié Dorfin comme un nouveau partenaire de liaison de PSD-95 et identifié un certain nombre de protéines dont les niveaux d'ubiquitination sont diminués chez les souris Dorfin-/-.

La signification fonctionnelle de l'interaction entre Dorfin et PSD-95 n'a pas été directement explorée dans la présente étude. Cependant, étant donné que PSD-95 est une protéine d'échafaudage abondante enrichie au niveau des synapses excitatrices, il est possible que PSD-95 puisse favoriser le ciblage synaptique de Dorfin, comme démontré pour de nombreuses autres protéines interagissant avec PSD-95. Alternativement, parce que PSD-95 est une protéine multi-domaine qui interagit avec diverses protéines membranaires, de signalisation et d'échafaudage/d'adaptation49 et les ligases E3 interagissent souvent avec des protéines d'adaptation/d'échafaudage pour élargir le spectre des protéines de substrat1,2,3,4,5, PSD-95 pourrait fonctionner comme une passerelle à travers laquelle Dorfin interagit avec divers substrats. Cela rappelle l'interaction entre la protéine synaptique PDZ CASK/LIN-2 et Parkin50, une ubiquitine ligase E3 connue pour réguler négativement le nombre et la force des synapses excitatrices51 et protéger les neurones postmitotiques de l'excitotoxicité52. Un autre exemple est l'interaction de Piccolo et Bassoon, deux grandes protéines de zone active contrôlant l'assemblage des protéines présynaptiques53, avec Siah1 (une ubiquitine ligase E3), qui est censée favoriser le maintien de l'intégrité synaptique en modulant la dégradation des protéines présynaptiques30.

Les souris Dorfin-/- présentaient deux phénotypes synaptiques dans l'hippocampe : augmentation de l'amplitude du mEPSC dans les cellules granulaires DG et augmentation de la LTP induite par HFS au niveau des synapses MPP-DG. Ces résultats suggèrent que Dorfin pourrait avoir des influences négatives sur les AMPAR synaptiques ainsi que sur la LTP. Sur le plan comportemental, les souris Dorfin−/− ont montré une déficience spécifique dans le conditionnement contextuel de la peur, mais pas dans d'autres types d'apprentissage et de mémoire, y compris l'apprentissage et la mémoire spatiaux (labyrinthe d'eau Morris), la nouvelle mémoire de reconnaissance d'objets, la mémoire de travail spatiale (labyrinthe en T), extinction de la peur, conditionnement de la peur et séparation des modèles.

On ne sait pas comment la suppression de Dorfin entraîne une augmentation de l'amplitude du mEPSC et de la LTP dans le DG, bien qu'elle implique probablement une augmentation du nombre ou de la fonction des AMPAR dans des conditions basales ou pendant la LTP. La phosphorylation de deux sites sur la sous-unité GluA1 des AMPAR, S831 et S845, a été impliquée dans la régulation des propriétés biophysiques des AMPAR et de la plasticité synaptique médiée par les AMPAR54,55. Cependant, nos données ont indiqué que les niveaux de ces phosphorylations étaient inchangés dans le cerveau Dorfin-/-, excluant cette possibilité.

Nos données fournissent un soutien supplémentaire à l'idée que les ligases d'ubiquitine E3 régulent la plasticité synaptique, l'apprentissage et la mémoire. Il a été démontré qu'une déficience maternelle en Ube3A (protéine ubiquitine ligase E3A) supprime la LTP et altère le conditionnement contextuel de la peur chez la souris56. De plus, Praja2 (doigt annulaire praja 2, protéine ligase d'ubiquitine E3) chez le rat supprime la LTP57 tardive. La LTP tardive et le conditionnement contextuel de la peur sont supprimés chez les souris Mindbomb-1−/−58 et APC/C-Cdh1−/−59,60. Enfin, une LTP améliorée et un conditionnement de la peur supprimé sont observés chez les souris Scrapper-/- et Scrapper+/-, respectivement61,62.

Nos résultats sont uniques en ce sens qu'une délétion E3 dans la région DG (et non CA1) de l'hippocampe modifie la LTP, l'apprentissage et la mémoire. Ceci est conforme à l'association rapportée de cellules granulaires DG hippocampiques avec un comportement spatial et un conditionnement contextuel de la peur63,64,65. De plus, cela suggère que les ligases E3 dans diverses régions du cerveau en plus de la région CA1 de l'hippocampe sont importantes pour la régulation de la plasticité synaptique, comme observé précédemment dans l'amygdale des souris APC/C-Cdh1−/−66, striatum de Parkin−/ − souris67 et cortex visuel de souris Ube3am−/p+68.

Une découverte notable était que la LTP améliorée - et non réduite - chez les souris Dorfin-/- était associée à un conditionnement contextuel de la peur altéré, contrairement à nos attentes. Cependant, des études antérieures sur des souris dépourvues, par exemple, des protéines Fmr2, Gα1, PDE4D, IRSp53 et SCRAPPER, ont lié une LTP hippocampique améliorée dans la voie collatérale de Schaffer à une diminution du conditionnement contextuel de la peur61,62,69,70,71,72,73. Ces résultats, ainsi que les nôtres, suggèrent qu'une déviation de la LTP de l'hippocampe dans les deux sens dans la région DG ou CA1 peut entraîner des troubles similaires de l'apprentissage et de la mémoire.

Bien que les mécanismes conduisant à une LTP améliorée et à une altération du conditionnement contextuel de la peur chez les souris Dorfin-/- restent à déterminer, la liste des protéines dont les niveaux d'ubiquitination ont été réduits de plus de 2,5 fois chez les souris Dorfin-/- pourrait fournir quelques points de départ. En effet, nombre de ces protéines sont enrichies en densité postsynaptique (PSD) et ont été impliquées dans la régulation de la transmission synaptique excitatrice, de la plasticité synaptique et de l'apprentissage et de la mémoire (tableau supplémentaire S1). Par exemple, Rab11a/b favorise la translocation des endosomes de recyclage dans les épines dendritiques et l'exocytose locale de GluA1 pendant LTP74,75,76,77. Par conséquent, l'ubiquitination dépendante de Dorfin et la dégradation des protéines Rab11a/b réguleraient négativement la LTP. De plus, les souris transgéniques dans lesquelles les adaptateurs de signalisation 14-3-3η et 14-3-3ζ sont fonctionnellement inhibés par l'expression génétique d'une protéine inhibitrice présentent des réductions du contenu synaptique des NMDAR, de la transmission synaptique médiée par NMDAR, de la LTP et du conditionnement contextuel de la peur78 , suggérant que 14-3-3η et 14-3-3ζ régulent positivement la plasticité synaptique ainsi que l'apprentissage et la mémoire. Par conséquent, ces fonctions peuvent être supprimées par la dégradation de la protéine 14-3-3 dépendante de Dorfin.

Contrairement à nos attentes initiales, nos données indiquent que certaines des protéines qui présentaient une diminution de l'ubiquitination chez les souris Dorfin-/- étaient exprimées à des niveaux normaux dans le cerveau mutant, malgré notre démonstration qu'elles s'associent à Dorfin in vitro. Cependant, il a été démontré que l'ubiquitination des protéines a des fonctions autres que la dégradation des protéines, telles que la modulation de la fonction des protéines, l'endocytose et la localisation subcellulaire, ainsi que les interactions protéine-protéine1,2,3,4,5. Nos données indiquent qu'au moins les cinq protéines dont nous avons démontré qu'elles formaient un complexe avec Dorfin (Rab11b, neurofilament-M, sous-unité catalytique PP1-α, sous-unité catalytique PP1-β et histone H2A.Z) ne sont pas directement ubiquitinées dans les cellules hétérologues. Étant donné que ces protéines se sont avérées moins ubiquitinées dans l'hippocampe Dorfin-/- grâce à un dépistage impartial, leur ubiquitination pourrait nécessiter certaines conditions uniques aux environnements neuronaux / cérébraux, ou certaines protéines autres que ces cinq protéines peuvent être ubiquitinées par Dorfin dans hétérologues. cellules.

Enfin, nos résultats indiquent que la neurogenèse dans le Dorfin-/- DG adulte est supprimée. Étant donné que la neurogenèse adulte dans le DG a été impliquée dans la régulation de la plasticité synaptique au niveau des synapses du DG et des comportements dépendants de l'hippocampe, y compris la séparation des modèles et l'apprentissage et la mémoire spatiaux/contextuels, la neurogenèse réduite chez l'adulte Dorfin-/- La DG pourrait être associée à la LTP améliorée et au conditionnement contextuel de la peur altéré chez ces souris. Cependant, comme il a été démontré qu'une neurogenèse adulte réduite supprime à la fois la LTP et la LTD80, nos résultats, où la neurogenèse réduite était associée à une LTP améliorée (mais non supprimée), diffèrent des résultats précédents. Cependant, une neurogenèse réduite chez le DG adulte a été associée à une performance réduite dans le conditionnement contextuel de la peur dans des études précédentes45,81, ce qui est conforme à nos résultats.

En conclusion, notre étude identifie l'ubiquitine ligase E3 Dorfin comme un nouveau ligand de PSD-95 et fournit des preuves in vivo soutenant l'hypothèse selon laquelle Dorfin peut réguler la neurogenèse adulte, la transmission synaptique excitatrice, la plasticité synaptique et le conditionnement contextuel de la peur.

L'ADNc de Dorfin pleine longueur a été amplifié par PCR à partir d'une bibliothèque d'ADNc de cerveau de rat et sous-cloné dans GW1 (British Biotechnology). Pour Flag-Dorfin, le rat Dorfin dans GW1 a été amplifié par PCR et sous-cloné dans le vecteur p3XFLAG-CMV-7.1 (Sigma). Pour Myc-Dorfin, le rat Dorfin pleine longueur a été sous-cloné dans pGW1-Myc. PSD-95 pleine longueur, EGFP-PSD-93, EGFP-SAP97, EGFP-SAP102, EGFP-S-SCAM, Myc-GRIP2 pour le pull down GST ont été décrits82. Le pCFP-Rab11b complet était un cadeau aimable du Dr Wondo Heo du KAIST. Les pEGFP-mNFM, pEGFP-PP1α, pEGFP-PP1β et pRK5-HA-Ub pleine longueur ont été obtenus auprès d'Addgene (ID # 32909, 44224, 44223 et 17608 respectivement). pEGFP-H2Afz a été amplifié par PCR à partir d'une banque d'ADNc de cerveau de souris et sous-cloné dans pEGFP-N1.

Les anticorps suivants ont été décrits : EGFP83, PSD-93, SAP97, SAP102, S-SCAM84 et GluA185. Les anticorps suivants ont été achetés auprès de sources commerciales : souris monoclonale PSD-95 K28/43, GluN2B N59/36 (UC Davis/NIH NeuroMab Facility) NR1/GluN1 (BD Pharmingen), GluN2A, NPEPPS, NeuN (Millipore), pGluR1 S831 et S845 (signalisation cellulaire), GluA2, Myc polyclonal de lapin et monoclonal de souris, ATP6V1A, Rab11, 14-3-3η, 14-3-3ζ, PP1, ubiquitine (Santa Cruz Biotechnology), HA monoclonal de souris (Roche Molecular Biochemicals), souris Flag monoclonal M2 (Sigma), α-tubuline (Sigma), GABARα1 (SySy), doublecortine, plexine A1 et A4, gelsoline (Abcam), BrdU (Novus Biologicals). Des tests d'immuno-blot ont été effectués à l'aide d'Odyssey Fc (LI-COR Biosciences).

Les 7 derniers acides aminés de Dorfin de souris (aa 834–840, WT et I840A) ont été générés en annelant des oligonucléotides et en les sous-clonant dans pBHA. Les domaines PDZ de diverses protéines ont été sous-clonés dans pGAD10 (un vecteur proie : Clontech) comme décrit précédemment86. Des tests de levure à deux hybrides ont été effectués comme décrit précédemment87.

Pour le pull down, les sept derniers acides aminés de Dorfin de souris (aa 834–840, WT et I840A) ont été générés en annelant des oligonucléotides et en les sous-clonant dans pGEX-4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech). Pour le pull down, les cellules HEK293T ont été transfectées avec PSD-95, EGFP-SAP97, EGFP-PSD-93, EGFP-SAP102, EGFP-S-SCAM, Myc-GRIP2. Les précipités extraits ont été analysés par immunotransfert avec les anticorps PSD-95, EGFP et Myc.

L'hybridation in situ a été réalisée comme décrit précédemment82. Des sondes d'hybridation pour l'ARNm de Dorfin de souris ont été préparées à l'aide de nt 2161–2820 de Dorfin de souris (NM_013923.2) et sous-clonées dans le vecteur pGEM-7Zf. Des sondes d'hybridation pour l'ARNm de Dorfin de rat ont été préparées à l'aide de nt 2609–3187 de Dorfin de rat (NM_001130560.1) et sous-clonées dans le vecteur pGEM-7Zf.

Myc-Dorfin et HA-ubiquitine ont été triplement ou doublement (sans Dorfin) transfectées avec EGFP-Rab11b, EGFP-NFM, EGFP-PPP1CA, PPP1CB-EGFP ou H2Afz-EGFP dans des cellules HEK293. Des lysats cellulaires (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl) dilués dans un tampon de dilution (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100) ont été incubés avec des anticorps EGFP, suivi d'analyses d'immunoprécipitation et d'immunoblot.

Des souris Dorfin-/- ont été générées à partir de sperme de souris avec la cassette piège à gène insérée dans l'intron entre l'exon 2 et l'exon 3 du gène Dorfin, obtenu auprès de TIGM (OST244733). Des souris dans le bagage génétique de 129/SvEv ont été rétrocroisées avec des souris C57BL6 pendant plus de cinq générations. Les souris pour les expériences ont été obtenues par accouplement de souris hétérozygotes mâles et femelles. Les souris ont été maintenues conformément aux exigences de la recherche animale au KAIST et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de la recherche animale au KAIST (KA2012-19). Toutes les expériences impliquant des souris ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes. Les souris ont été logées dans un environnement de cage standard sous des cycles de lumière et d'obscurité de 12 heures.

Les amorces pour la PCR de génotypage étaient 5′-CGG-GCT-GGG-TTT-ACA-TAG-AA-3′ (WT 5′), 5′-GAC-CCA-AAT-GTC-CAT-CAA-CC-3′ ( WT 3′) et 5′-CAA-AAT-GGC-GTT-ACT-TAA-GC-3′ (Piège 5′). Les amorces pour RT-PCR étaient composées de 4 ensembles. Dorfin 1 : 5′-ACT-GAA-CGG-TTT-AAT-CCT-C-3′ et 5′-CTG-TTC-CAC-AGC-CTT-CTC-3′. Dorfin 2 : 5′-TGT-TTC-AAC-AGG-TTG-GAA-GTA-3′ et 5′-GCG-TTA-TCA-CTA-ACT-GTT-CCC-AAG-3′. Dorfin 3 : 5′-ATC-AAG-GGA-GCT-CAA-TGG-TGG-3′ et 5′-GCA-TCA-CAG-GTC-TGG-TTT-GG-3′Dorfin 4 : 5′-GCA- AGA-TGG-TGG-CAG-TTT-TT-3' et 5'-CTA-ATG-GGA-CCG-TCT-TCT-GC-3'. Les amorces pour la qPCR étaient 5′-ACT-GAA-CGG-TTT-AAT-CCT-C-3′ et 5′-CTG-TTC-CAC-AGC-CTT-CTC-3′.

Des tranches de cerveau ont été préparées à partir de souris à 4 et 8 semaines. Des coupes de cerveau (50 μm) ont été perméabilisées avec du TritonX-100 à 0,5 % pendant 30 min et colorées avec l'anticorps NeuN. Après 24 heures, les coupes ont été colorées avec des anticorps secondaires pendant 2 heures, suivies d'une acquisition d'image avec un microscope confocal (LSM780, Carl Zeiss).

La 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU, Sigma) a été injectée par voie intrapéritonéale (50 mg/kg) à des souris (6 semaines) pendant 3 jours. Cinq jours après la dernière injection, les souris ont été perfusées avec 4 % de paraformaldéhyde. Des tranches de cerveau fixes (50 μm) obtenues par vibratome ont été incubées dans du HCl 1N pendant 10 min sur de la glace, suivies de HCl 2N pendant 10 min à température ambiante avant de les déplacer dans un incubateur à 37 ° C pendant 20 min. Un tampon borate (0,1 M) a été ajouté aux tranches pendant 12 min à température ambiante. Les tranches ont ensuite été incubées avec des anticorps BrdU et DCX à 4 ° C pendant 12 heures, suivies d'une coloration et d'un montage d'anticorps secondaires à l'aide de Vectashield et DAPI. Les images de coupe ont été acquises par microscopie confocale (LSM780, Zeiss).

Les neurones pyramidaux de la région CA1 et les cellules granulaires de la région DG de l'hippocampe ont été choisis au hasard et infusés avec de la biocytine (0, 5%) pendant 5 min. Après injection, les tranches ont été prélevées et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 heures. Les tranches ont été colorées par l'anticorps streptavidine. Les images ont été capturées à l'aide d'objectifs 20 × (LSM 780, Carl Zeiss). Les intersections de branches dendritiques ont été analysées manuellement en aveugle.

La fraction synaptosomale brute (P2) d'hippocampes de souris adultes (2 à 3 mois) a été préparée comme décrit précédemment88. Des lysats d'hippocampe/DG entiers ont été préparés en utilisant un tampon d'homogénéisation (saccharose 0,32 M, HEPES 10 mM, EDTA 2 mM). Pour la microdissection DG, nous avons utilisé un vibratome pour couper des tranches de cerveau (400 μm) et disséquer DG.

Les tissus hippocampiques ont été congelés dans de l'azote liquide, suivis de l'analyse Ubiscan (signalisation cellulaire) par immunoprécipitation du peptide K-GG et LC-MS/MS (LTQ-Orbitrap-Velos et ESI-CID). Les spectres MS/MS ont été analysés à l'aide de SEQUEST 3G et de la plateforme SORCERER 2 de Sage-N Research (v 4.0, Milpitas CA).

Des tranches sagittales d'hippocampe (300 μm pour les enregistrements de cellules entières, 400 μm pour les enregistrements de terrain) ont été préparées à l'aide d'un vibratome (VT1200S, Leica) dans un tampon de coupe glacé (saccharose 212 mM, NaHCO3 25 mM, KCl 5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, 10 mM de D-glucose, 2 mM de pyruvate de sodium, 1,2 mM d'ascorbate de sodium, 3,5 mM de MgCl2 et 0,5 mM de CaCl2 barbotés avec 95 % d'O2/5 % de CO2) et récupérés à 32 °C dans du aCSF (125 mM de NaCl, 25 mM de NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM D-glucose, 1,3 mM MgCl2 et 2,5 mM CaCl2). Après 30 min, les tranches ont été maintenues à température ambiante. Des enregistrements de patch-clamp de cellules entières et des enregistrements de potentiel de champ ont été effectués comme décrit précédemment72. Les enregistrements ont été effectués à l'aide d'un amplificateur Multiclamp 700B et d'un Axopatch 200B. Les données ont été analysées à l'aide de Clampfit 10.2 (Molecular Devices).

Les enregistrements de cellules entières pour les mEPSC et le rapport NMDA/AMPA ont été réalisés avec des pipettes d'enregistrement (3–5 MΩ) remplies de solution interne (117 mM CsMeSO4, 10 mM TEA-Cl, 8 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM QX-314 -Cl, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP et 10 mM EGTA). Pour les mesures de mIPSC, les pipettes ont été remplies d'une solution contenant 115 mM de CsCl, 10 mM de TEA-Cl, 8 mM de NaCl, 10 mM d'HEPES, 5 mM de QX-314-Cl, 4 mM de Mg-ATP, 0,3 mM de Na-GTP, EGTA 10 mM. Toutes les solutions internes ont été ajustées pour acquérir un pH de 7,3 et 290–300 mOsm. Les signaux ont été filtrés à 1,0 kHz pour les mEPSC et les mIPSC et à 2,0 kHz pour les expériences de rapport NMDA/AMPA. Pour les mEPSC, de la picrotoxine (50 μM) et du TTX (0, 5 μM) ont été ajoutés à l'aCSF. Pour l'enregistrement mIPSC, de la picrotoxine (50 μM), du NBQX (10 μM) et de l'AP5 (25 μM) ont été ajoutés. Pour les expériences de rapport NMDA/AMPA, de la picrotoxine (100 μM) a été ajoutée. Les enregistrements mEPSC et mIPSC ont été effectués à un potentiel de maintien de -70 mV pendant 2 min. Pour les expériences de rapport NMDA/AMPA, les EPSC ont été évoqués avec une pipette en verre contenant un aCSF positionné dans la voie MPP-DG. Les EPSC AMPA ont été enregistrés à -70 mV. Après avoir obtenu 25 à 30 traces stables, le potentiel de maintien a été changé à + 40 mV pour enregistrer les EPSC NMDA (20 traces). Les EPSC NMDA à 50 ms après la stimulation ont été utilisés pour le rapport NMDA/AMPA.

Des enregistrements de potentiel de champ ont été effectués avec des pipettes d'enregistrement remplies d'aCSF. Pour les enregistrements d'entrée / sortie et de rapport d'impulsions appariées, des fEPEP stables ont été enregistrées pendant 10 minutes avant le début des expériences principales. Pour les enregistrements d'entrée/sortie, les stimuli ont été progressivement augmentés pour induire des amplitudes de volée de fibre de 0, 05 à 0, 3 mV / ms et 3 traces par stimulus ont été enregistrées. Pour les enregistrements de rapports d'impulsions appariés, les intervalles inter-stimulus étaient de 25, 50, 100, 200 et 300 ms. Les enregistrements ont été répétés 3 fois. Pour la LTP de stimulation à haute fréquence, de la picrotoxine (100 μM) a été ajoutée à l'aCSF. Après avoir obtenu des réponses de base stables pendant 20 min, un seul stimulus de 100 Hz (1 sec) a été donné à la voie SC-CA1 et quatre trains de stimuli de 100 Hz (chacun 1 sec ; 20 sec d'intervalle inter-train) ont été donnés à le parcours MPP-DG. Les réponses ont été enregistrées pendant une heure.

Pour un suivi continu à long terme des mouvements de souris, nous avons utilisé le système LABORASTM (Metris), conçu pour détecter les vibrations provenant des mouvements d'une souris dans la cage. Les souris ont été isolées et habituées dans des cages LABORAS dans la salle d'enregistrement pendant 3 jours. Après accoutumance, la cage LABORAS avec une souris a été placée au-dessus d'une plate-forme d'enregistrement sensible aux vibrations pendant 72 heures. Les données des dernières 48 heures ont été analysées et moyennées sur des cycles de 24 heures.

Les souris ont été placées dans une boîte de 40 × 40 × 40 cm et enregistrées de leur activité locomotrice horizontale dans l'obscurité totale (~ 0 lux) pendant une heure. La ligne de la zone médiane était à 10 cm du bord. Les mouvements ont été analysés à l'aide d'Ethovision XT 10 (Noldus).

Le labyrinthe, élevé à une hauteur de 50 cm du sol, se composait de deux bras ouverts, de deux bras fermés et d'une zone centrale. Les souris placées sur la zone centrale ont été enregistrées de leurs mouvements pendant 7 min et analysées manuellement du temps passé à bras fermés ou ouverts.

La boîte avait une dimension de 12 × 30 × 20 cm pour la chambre lumineuse (~ 250 ~ 300 lux) et 14 × 13 × 20 cm pour la chambre noire (~ 0 ~ 5 lux). Une souris a été placée au centre de la chambre lumineuse, suivie d'une surveillance des mouvements pendant 10 min. Le temps passé dans la chambre claire ou sombre a été analysé manuellement.

Les souris ont été privées de nourriture pendant 24 heures et placées dans une nouvelle boîte de 40 × 40 × 40 cm. Une boulette de nourriture a été placée au centre de la boîte et la latence pour approcher et manger la nourriture a été mesurée.

Les souris ont été placées dans une cage à domicile vide et ont enregistré leur comportement d'auto-toilette pendant 10 min. Le comportement d'auto-toilette a été défini comme caresser ou gratter les zones du visage, de la tête ou du corps avec les membres antérieurs, ou lécher des parties du corps. Le temps de toilettage a été mesuré en aveugle.

Les souris ont reçu une injection de 50 μg/poids (g) de pentylènetétrazole (PTZ) dans la cavité intrapéritonéale et enregistré des crises pendant 10 min. Les convulsions étaient définies comme des mouvements convulsifs incluant des convulsions cloniques et/ou tonico-cloniques en position couchée sur le côté et/ou des sauts sauvages.

Ce test a été réalisé pour mesurer l'interaction sociale et la reconnaissance de la nouveauté sociale89. L'appareil était composé de 3 chambres de dimension 12 × 20 × 26 cm pour la chambre centrale et 14 × 20 × 26 cm pour les chambres latérales. Les deux chambres latérales avaient des cages en plastique dans le coin pour placer des objets ou des souris. L'expérience consistait en 4 sessions, y compris l'habituation dans la cambrure centrale (10 min), l'habituation dans toutes les chambres (10 min), l'exploration objet/souris (10 min) et l'exploration ancienne/nouvelle souris (10 min). Lors de la troisième session, une souris étrangère WT a été délicatement confinée dans une cage en plastique et un objet inanimé a été placé dans la cage en plastique opposée. Les souris ont été autorisées à se déplacer librement et à explorer et à renifler et les temps de chambre ont été mesurés pour l'analyse de l'interaction sociale. Le reniflement a été défini comme le nez de la souris tourné vers et se rapprochant de l'objet cible ou de la souris. Lors de la dernière session, l'objet a été remplacé par une nouvelle souris étrangère WT. Les positions de l'objet et de l'étranger 1 ont été alternées de manière aléatoire pour éviter la préférence latérale.

Les souris ont été placées doucement sur la tige rotative de l'appareil rotarod (Stoelting), suivi d'une augmentation de la vitesse de la tige de 4 à 40 tr/min en 5 min. Les expériences ont été réalisées pendant 5 jours consécutifs, mesurant la latence à tomber de la tige.

Des souris dans un réservoir circulaire (100 cm de diamètre) rempli d'eau blanche opaque (22–24 ° C) ont été entraînées à trouver une plate-forme cachée (10 cm de diamètre). La phase d'apprentissage consistait en 3 essais par jour pendant 5 jours. Pour le test de sonde (1 min), la plate-forme a été retirée et le temps passé par une souris à explorer chaque quadrant a été mesuré. Dans le test d'inversion (3 jours), la plate-forme a été déplacée vers la position du quadrant opposé. Les mouvements de la souris ont été analysés à l'aide d'EthoVision XT 10 (Noldus)

Ce test a été effectué comme décrit précédemment44. En bref, des souris sous-alimentées avec un poids corporel de 80 à 85% d'une plage normale ont été habituées à l'arène du labyrinthe en T pendant 5 min pendant 2 jours, suivies d'un entraînement avec 20 μl de récompense de lait à 70% pendant 10 jours.

Les souris placées au point de départ ont été autorisées à explorer librement les deux bras du labyrinthe. Lorsqu'une souris entre dans l'un des deux bras, elle est ramenée au point de départ après avoir passé 5 secondes dans le bras pour le tour suivant, répété 10 fois.

Des souris, habituées à une boîte en plein champ pendant 60 min le jour 1, ont reçu deux objets identiques pendant 11 min le jour 2. Le jour 3, l'un des objets a été remplacé par un nouveau. La reconnaissance d'objet a été mesurée par le temps pendant lequel le nez de la souris a pointé l'objet.

Au jour 1, les souris ont été habituées à la chambre de choc (Coulbourn Instruments) pendant 5 min. Le jour 2, une souris a passé 3 min dans la chambre avant de recevoir des chocs au pied (0, 8 mA) à 3, 4 et 5 min et les niveaux de congélation pendant 3 à 6 min ont été quantifiés. Au jour 3, les souris ont été réexposées à la chambre sans choc au pied pendant 5 min et les niveaux de congélation pendant ces 5 min ont été quantifiés. Le comportement de congélation a été analysé à l'aide du logiciel FreezeFrame 3 (Coulbourn Instruments). Pour l'extinction contextuelle de la peur, les souris ont été exposées à la même chambre de choc pendant 5 min pendant 10 jours consécutifs.

Les souris sans accoutumance ont passé 3 minutes dans la chambre de choc du contexte A avant de recevoir un signal auditif (4 kHz, 75 dB) pendant 30 secondes qui s'est terminé par un choc au pied de 2 secondes (0, 8 mA). Ce conditionnement a été répété 3 fois à une minute d'intervalle. Vingt-quatre heures plus tard, une souris a été placée dans le contexte B où elle a passé 3 min avant de recevoir le même signal auditif pendant 3 min. Le comportement de congélation pendant cette période de 3 min a été analysé.

Nous avons soumis des souris à un test de conditionnement contextuel de la peur en utilisant une paire de contextes moins distincts (A et B) qui partageaient un sol en grille métallique identique, mais avaient un papier peint, une couleur de fond et un éclairage uniques. Dans ce protocole, le conditionnement de la peur s'est déroulé progressivement sur plusieurs jours afin d'étudier les effets d'expériences répétées. Les expériences ont été réalisées dans les mêmes conditions de temps, de température et d'humidité : 14h-21h, 20-22 °C et 45 %. Chaque essai a été réalisé après habituation dans leur cage pendant 30 à 60 min et deux fois par jour. Pendant les jours 1 à 3 de l'expérience, les souris ont été placées dans une chambre de choc pendant 180 s, ont reçu un seul choc au pied de 0, 8 mA pendant 2 s et ont été retirées après 60 s. Aux jours 4 et 5, à des fins de généralisation, les souris de chaque génotype ont été divisées en deux groupes, l'un visitant la chambre A et l'autre visitant la chambre B (un essai/jour) pendant 4 min le jour 4 et visitant les chambres non visitées le jour 5. Les souris n'ont pas reçu de choc au pied pendant la généralisation et la congélation a été évaluée. Pendant les jours 6 à 13, pour l'entraînement à la discrimination, les souris ont visité les deux chambres tous les jours pendant 8 jours, recevant toujours un choc au pied (0,8 mA pendant 2 s) à 180 s après avoir été placées dans la chambre A mais pas dans la chambre B, suivi 1 séjour de plus min. La congélation pendant les 3 premières minutes d'exposition dans chaque chambre a été utilisée pour calculer le rapport de discrimination quotidien.

Tous les résultats comportementaux ont été analysés en aveugle.

Comment citer cet article : Park, H. et al. Les souris dépourvues de la ligase E3 interagissant avec PSD-95, Dorfin / Rnf19a, affichent une neurogenèse adulte réduite, une potentialisation à long terme améliorée et un conditionnement contextuel de la peur altéré. Sci. Rep. 5, 16410; doi : 10.1038/srep16410 (2015).

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Ce travail a été soutenu par le programme de recherche sur le cerveau par l'intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financé par le ministère des Sciences, des TIC et de la planification future (2014047939 à HK) et l'Institut des sciences fondamentales (IBS) (IBS-R002-D1 à EK).

Graduate School of Medical Science and Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), Daejeon, 305-701, Corée

Parc Hanwool

Département des sciences biologiques, KAIST, Daejeon, 305-701, Corée

Jinhee Yang, Ryunhee Kim, Chungwoo Lee, Jongil Park et Eunjoon Kim

Center for Synaptic Brain Dysfunctions, Institute for Basic Science (IBS), Daejeon, 305-701, Corée

Yan Li, Yeunkum Lee et Eunjoon Kim

Département d'anatomie et division du cerveau Corée 21. Sciences biomédicales, Faculté de médecine, Université de Corée, Séoul, 136-704, Corée

Dongmin Lee et Hyun Kim

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JY a réalisé Y2H, pull down et une partie des expériences de co-immunoprécipitation ; RK a effectué une partie des expériences électrophysiologiques et des expériences de neurogenèse chez l'adulte ; YL a réalisé des expériences de neurogenèse chez l'adulte ; YL a effectué des tests d'ubiquitination in vitro ; JP et CL ont réalisé une partie des expériences comportementales ; DL a réalisé des expériences d'hybridation in situ ; HP a effectué toutes les autres expériences ; EK et HK ont écrit le manuscrit.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

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Park, H., Yang, J., Kim, R. et al. Les souris dépourvues de la ligase E3 interagissant avec PSD-95, Dorfin / Rnf19a, affichent une neurogenèse adulte réduite, une potentialisation à long terme améliorée et un conditionnement contextuel de la peur altéré. Sci Rep 5, 16410 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16410

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Reçu : 01 juin 2015

Accepté : 14 octobre 2015

Publié: 10 novembre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep16410

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